DB12 T 505-2014 玉米转基因成分筛查方法.pdf
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1、B 04ICS 65.020.01 天 津 市 地 方 标 准 DB12DB12/T 5052014 玉米转基因成分筛查方法 Screening method for genetically modified maize 2014-04-22发布 2014-07-20实施天津市质量技术监督局发布 DB12/T 5052014 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由天津市质量技术监督局提出。 本标准起草单位:天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。 本标准主要起草人:黄凤军、李建、赵新、陈杰、易萌、朱珠、马强、杨炳存。 本标准2014
2、年04月首次发布。 DB12/T 5052014 1 玉米转基因成分筛查方法 1 范围 本标准规定了玉米中转基因成分定性PCR筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。 本标准适用玉米及其制品中 zSSIIb 内标准基因、CaMV35S 启动子、NOS 终止子、Bt 基因、bar基因、HPT基因的定性PCR筛查检测 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求
3、农业部2031号公告192013 转基因植物及其产品检测 抽样 农业部1485号公告42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 zSSIIb基因 zSSIIb gene 编码玉米淀粉合酶异构体zSTS-2的基因。 3.2 CaMV 35S启动子 35S promoter from cauliflower mosaic virus (CaMV) 来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。 3.3 NOS终止子 terminator of nopaline synthase (NOS) gene 来自胭脂碱合成酶基因NOS的终止子。 3.
4、4 Bt基因 Bt(Bacillus thuringiensis)gene 来源与苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),可表达一种杀虫晶体蛋白的基因,常见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。 3.5 bar基因 bialaphos resistance gene 来源于土壤吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus),编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinthricin acetyltransferase,PAT)。该酶具有对除草剂草丁膦(glufosinate)的耐受性。 3.6 HP
5、T基因 HPT gene 来源于大肠杆菌或链球菌(Streptomyceshy groscopicus),编码潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase)的基因。 DB12/T 5052014 2 4 检测方法 4.1试剂和材料 4.1.1 实验用水为重蒸馏水或符合GB/T 6682规定的一级水。 4.1.2 琼脂糖。 4.1.3 10 g/L溴化乙锭溶液:称取1.0 g溴化乙锭(EB),溶于100 mL水中,避光保存。 注:溴化乙锭有致癌作用,配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。 4.1.4 10 mol/L氢氧化钠溶液:在160 mL水中加入80
6、.0 g氢氧化钠(NaOH),溶解后再加水定容到200 mL。 4.1.5 500 mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8.0):称取18.6 g乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2),加入70 mL水中,再加入适量氢氧化钠溶液(4.1.4),加热至完全溶解后,冷却至室温,用氢氧化钠溶液(4.1.4)调pH至8.0,加水定容至100 mL。在103.4 kPa(121 )条件下灭菌20 min。 4.1.6 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(pH 8.0):称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800 mL水中,用盐酸调pH至8.0,加水定容至1 000 mL。在103
7、.4 kPa(121 )条件下灭菌20 min。 4.1.7 TE缓冲液(pH 8.0):分别量取10 mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(4.1.6)和2 mL乙二铵四乙酸二钠溶液(4.1.5),加水定容至1 000 mL。在103.4 kPa(121 )条件下灭菌20 min。 4.1.8 50TAE缓冲液:称取242.2 g三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用300 mL水加热搅拌溶解后,加100 mL乙二铵四乙酸二钠溶液(4.1.5),用冰乙酸调pH至8.0,然后加水定容到1 000 mL。使用时用水稀释成1TAE。 4.1.9 加样缓冲液:称取250.0 mg溴酚蓝,加10 mL水,在室温
8、下溶解12 h;称取250.0 mg二甲基苯腈蓝,用10 mL水溶解;称取50.0 g蔗糖,用30 mL水溶解。混合以上三种溶液,加水定容至100 mL,在4 下保存。 4.1.10 DNA分子量标准:可以清楚的区分50 bp1 000 bp的DNA片段。 4.1.11 dNTPs混合溶液:将浓度为10 mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。 4.1.12 Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液及25 mmol/L氯化镁溶液。 4.1.13 引物:玉米内标准基因和转基因玉米外源基因检测时所用的引物序列见表1。 表1 玉米内标准基因和转基因玉米外源
9、基因引物序列 检测基因 引物序列 扩增片段长度 基因性质 zSSIIb zSSIIb -F:5- CTCCCAATCCTTTGACATCTGC -3 zSSIIb -R:5- TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG -3 151 bp 内标准基因 CaMV 35S 35S -F:5-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 35S -R:5-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 195 bp 外源基因 NOS NOS -F:5-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3 NOS -R:5-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 180 bp 外源基因
10、Bt Bt -F:5- GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC -3 Bt -R:5- CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3 301 bp 外源基因 bar bar -F:5- GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 bar -R:5- CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3 262 bp 外源基因 DB12/T 5052014 3 HPT hpt -F:5- GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT -3 hpt -R:5- AGATGTTGGCGACCTCGTATT -3 472 bp 外源基因 4.1.14 引物溶液:用TE缓冲液(4.1.7)或水分别将
11、上述引物稀释到10 mol/L。 4.1.15 石蜡油。 4.1.16 PCR产物回收试剂盒。 4.1.17 DNA提取试剂盒。 4.2 仪器 4.2.1 分析天平:感量0.1 g 和0.1 mg。 4.2.2 PCR扩增仪:升降温速度1.5 /s,孔间温度差异1.0 。 4.2.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置。 4.2.4 紫外透射仪。 4.2.5 凝胶成像系统或照相系统。 4.2.6 重蒸馏水发生器或纯水仪。 4.2.7 其他相关仪器设备。 4.3 分析步骤 4.3.1 抽样 按NY/T 672 和农业部2031号公告192013规定的执行。 4.3.2 试样准备 按NY/T 672 和农业
12、部2031号公告192013规定的执行。 4.3.3 试样预处理 按农业部1485号公告42010规定的执行。 4.3.4 DNA模板制备 按农业部1485号公告42010规定的执行。 4.3.5 PCR反应 4.3.5.1 试样PCR反应 4.3.5.1.1 每个试样PCR反应设置3次重复。 4.3.5.1.2 在PCR反应管中按表2依次加入反应试剂,混匀,再加25 L石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加)。 表2 PCR检测反应体系 试剂 终浓度 体积 水 10PCR缓冲液 1 2.5 L DB12/T 5052014 4 25 mmol/L氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dN
13、TPs混合溶液(各2.5 mmol/L) 各0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L上游引物 0.10.5 mol/L 0.251.25 L 10 mol/L下游引物 0.10.5 mol/L 0.251.25 L Taq酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA模板 2 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L 根据Taq酶的浓度确定其体积,并相应调整水的体积,使反应体系总体积达到25.0 L。如果PCR 缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,加等体积水。 注1:玉米内标准基因PCR检测反应体系中,上下游引物分别为zSSIIb -F和zSSIIb-R,引物终浓度分别为0.2m
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