GB T 26425-2010 饲料中产气荚膜梭菌的检测.pdf
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1、ICS 65. 120 B 46 道写中华人民11: 不日国国家标准G/T 26425-2010 饲料中产气芙膜梭菌的检测Method for determination of Clostridium per fringens in feeds (ISO 7937: 2004 , Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the enumeration of Clostridium户er斤lngens-Colony-count technique, MOD) 2011-01-14发布数码防伪中华人民
2、共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2011-07-01实施发布中华人民共和国国家标准饲料中产气英膜梭菌的检测GB/T 26425-2010 * 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤开本880X 1230 1/16 印张1字数24千字2011年5月第一版2011年5月第一次印刷* 书号:155066. 1-41957定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 26425-2010 目。
3、吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准使用重新起草法修改采用ISO7937: 2004(食品和动物饲料的微生物学产气英膜梭菌计数的水平方法菌落计数技术)(英文版。本标准与ISO7937 :2004相比在结构上有较多调整,附录B中列出了本标准与ISO7937: 2004的章条编号对照一览表。本标准与ISO7937 :2004相比存在技术性差异,这些差异涉及的条款已通过在其外侧页边空白位置的垂直单线(I )进行了标识,附录C中给出了相应技术性差异及其原因的一览表。本标准还做了下列编辑性修改:一一删除了ISO7937: 2004的目次;删除了ISO7937: 2004的引言;删
4、除了ISO7937: 2004的参考文献。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。本标准起草单位:广东省微生物分析检测中心。本标准主要起草人:朱红惠、孙晓棠、羊宋贞、陈远良、张鲜妓。I GB/T 26425-2010 饲料中产气英膜梭菌的检测1 范围本标准规定了饲料中产气英膜梭菌的检验方法。本标准适用于饲料中产气英膜梭菌的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 14699
5、. 1饲料采样(GB/T14699.1-2005 , ISO 6497:2002 , IDT) GB/T 20195动物饲料试样的制备(GB/T20195-2006 , ISO 6498:1998 ,IDT) SN/T 1538. 1-2005 培养基制备指南第1部分z实验室培养基制备质量保证通则(SN/T 1538.1-2005,ISO/TS 11133-1:2000,MOD) SN/T 1538. 2-2007培养基制备指南第2部分z培养基性能测试实用指南(SN/T1538. 2 2007 ,ISO/TS 11133-2 :2003 ,MOD) 3 原理3. 1 在平板中接种特定量待测液体
6、样品,或特定量其他类型待测样品初始悬液。在相同条件下接种待测样品或初始悬液的十倍梯度稀释物。浇注一层选择性培养基,凝固后再浇注一层此培养基覆盖。3.2 平板于37oc厌氧培养20h土2h。3.3 典型菌落计数。3.4 典型菌落的数量用确证试验证实,进一步计算每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数。4 稀释液、培养基及试剂除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂,实验室用水采用蒸锢水或去离子水,或相当纯度的水。4. 1 蛋白陈生理盐水稀释液:参见附录A中的A.L4.2 亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(SC):参见附录A中的A.20注:该培养基原称为无卵黄膝蛋白陈-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂CTSC)。4.3
7、 液体硫乙醇酸盐培养基:参见附录A中的A.3。4.4 乳糖亚硫酸盐(LS)培养基(可选):参见附录A中的A.4。4.5 动力硝酸盐培养基(可选):参见附录A中的A.5。4.6 硝酸盐还原试剂(可选):参见附录A中的A.6。4. 7 钵粉(可选):可选。4.8 乳糖-明胶培养基(可选):参见附录A中的A.7。1 GB/T 26425-2010 5 设备和玻璃器皿需配备微生物学常规设备和以下设备及玻璃器皿。5. 1 干热灭菌烘箱或湿热高压灭菌锅。5.2 恒温培养箱:37.C士1.C。5.3 厌氧培养装置或厌氧罐。5.4 pH计:精度到士O.1个单位。5.5 接种环、穿刺接种针z铅金丝或镰丝,一次性
8、使用的无菌用品亦可,接种环直径约3mm. 5.6 过滤除菌装置:用于溶液过滤除菌。5. 7 试管、锥形瓶、倒管:容积适当,试管16mmX160 mm. 5.8 吸管:1mL(具0.1mL刻度),10 mL(具0.5mL刻度。5.9 玻璃或塑料平板z直径9cm10 cm. 5.10 水浴锅:46.C士O.5 .C , 44 .C 4 7 .C可调。5. 11 橡胶吸耳球:必要时与具刻度的移液管一同用于配制硝酸盐还原试剂。6 采样实验室样品真实、具有代表性。采样工具,如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等,应是灭菌的。样品送到微生物检验室应越快越好。采样数量和方式按照GB/T14699. 1执行
9、。7 样品的制备按照GB/T20195进行试样的制备,样品制备后应尽快检验。8 操作步骤8. 1 检样制备、初始悬液和十倍稀释以元菌操作称取试样25g(mL)加入225mL蛋白陈生理盐水稀释液(4.1),均质1min2 min,制成1: 10的稀释液。吸取1: 10的稀释液1mL,加入9mL蛋白陈生理盐水稀释液,经充分混匀后制成1: 100的稀释液。更高稀释度可按此方法操作。8.2 接种和培养用元菌移液管吸取1mL初始悬液(若样品本身为液体,则直接吸取样液)加入到灭菌空平皿中央,每个样品做两个重复,每个平板挠注44.C47 .C水浴保温的SC培养基(4.2)10 mL15 mL,柔和转动平板,
10、使稀释液与培养基充分混匀。培养基凝固后,再于其上浇注10mL的SC培养基,待其凝固后,将平板倒置于庆氧培养装置(5.3)内,37.C厌氧培养20h士2h。培养时间不宜过长,否则会导致平板过度黑化。采用同样操作步骤进行1: 100的稀释物的接种和培养,必要时可采用同样操作步骤进行更高适宜稀释物的接种和培养。8.3 计数及菌落筛选培养后,选择长有150个菌落以下的平板,最好选择连续稀释度的平板,计数每皿中黑色菌落。然2 后从中选出5个黑色菌落用8.4.1或8.4.2中的任一种方法做确证试验。8.4 确证试验8.4.1 用LS培养基进行确证试验GB/T 26425-2010 注2因只有产气英膜梭菌和
11、不和谐梭茵(Clostrid i um absonum)这两种菌能在LS培养基(4.4)上46.C培养下生长,故采用此法进行确证试验不帘确保从SC培养基上选出的黑色菌落为纯培养即可转接至液体硫乙醇酸盐培养基进而转接到LS培养基上。8.4. 1. 1 培养及转种将每个选出的菌落接种至液体硫乙醇酸盐培养基(4.3),37.C厌氧培养18h24 h后,立即用灭菌移液管将5滴液体硫乙醇酸盐培养物转接到LS培养基中,水浴(5.10)中46.C需氧培养18h24 h。8.4. 1. 2 鉴别检查LS培养基中的倒管是否产气且是否呈黑色(为亚硫酸铁沉淀),LS培养基变黑且产气超过1/4小倒管的可确认为阳性;若
12、LS培养基变黑但产气不足1/4小倒管的,立即从中转接5滴至另一管LS培养基,于水浴中46.C培养18h24 h后,同上判断是否阳性。在SC培养基上形成特征性菌落,且用LS培养基确认为阳性的可认定为产气英膜梭菌,其他情况均应判为阴性。8.4.2 用动力硝酸盐培养基和乳糖-明胶培养基进行确证试验8.4.2. 1 概述用此法进行确证需确保用于确证的菌落得到良好分离。平板表面出现过度生长或不可能选出良好分离的特征菌落时,应将5个特征菌落接种至预脱气的液体硫乙薛酸盐培养基,37.C庆氧培养18h 24 h后,划线于SC基础琼脂平板(A.2.1)上,待划线干后,再覆盖10mL SC基础琼脂,凝固后置37.
13、C厌氧培养18h24 h后,从每一平板中选取至少1个良好分离的特征菌落,必要时重复于SC基础琼脂上划线及培养,直至获得良好分离的黑色菌落。再如8.4.2.2,8.4.2.3和8.4.2.4所述进行确证试验。8.4.2.2 动力硝酸盐培养基确证将选出的菌落穿剌接种至新鲜脱气的动力硝酸盐培养基(4.5),37 .C厌氧培养24h,观察接种线的生长情况,沿接种线周围呈扩散生长的为有动力,然后用有刻度的滴管和橡胶吸耳球滴加硝酸盐还原试剂(4.6)0.2 mLO. 5 mL,观察硝酸盐是否被还原,变红的为阳性。若15min内无红色产生,加少量钵粉10min后观察结果,此时若变红则表明元硝酸盐被还原,判为
14、阴性。产气英膜梭菌元动力,能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。警告:为了安全起见,滴加硝酸盐还原试剂应在通风榻中进行。8.4.2.3 转种及乳糖,明胶培养基确证试验将选出的菌落穿剌接种至新鲜脱气的乳糖-明肢培养基(4.肘,37.C厌氧培养24h,观察是否发酵乳糖,发酵乳糖者产气且变黄(因产酸), 5 .C放置1h,据其是否凝固检查明肢液化与否。此培养基凝固者,接着再培养24h,以检查明胶液化与否。8.4.2.4 鉴别SC培养基上形成黑色菌落,元动力,能还原硝酸盐,发酵乳糖产酸产气,48h内液化明胶者可判为3 G/T 26425-2010 产气英膜梭菌。产气英膜梭菌的硝酸盐还原反应迅速且强烈,仅有微弱硝酸
15、盐还原反应(如变成挑红色)者,应排除。9 结果计算与报告9. 1 每个平板中产气英膜梭菌的数量每个平板中产气英膜梭菌菌落数a的计算见式(1): a=去xC式中za一一每块平板上的产气英膜梭菌菌落数;b一挑取后经证实为产气英膜梭菌的菌落数;A一一一挑取平板上用于验证的菌落数;C一一平板上的所有特征菌落数。最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。示例:若某板上长有30个典型菌辘,从中选出做确证试验的5个菌中有4个证实为产气英膜梭菌,则=a=f 30=24 9.2 试样中产气英膜梭茵茵数的计算方法与报告9.2. 1 通常情况下试样中产气英膜梭菌菌敬的计算方法与报告. ( 1 ) 选择两个
16、连续稀释度平板(其上经确证后的产气英膜梭菌数介于15150之间),按式(2)计算1 mL或1g试样中的产气英膜梭菌菌数N.式中zN=_ L; a 一-V(nj + o. lnz)d N一一样品中产气英膜梭菌菌落数;L;a一一一所有平板经确证后的产气英膜梭菌菌落数的总和zV一一平板的接种体积,单位为毫升(mL);nj一一第一个稀释度的平板数;nz一一第二个稀释度的平板数;d 一一第一个稀释度的稀释因子未经稀释的液体样品的d值为1)。( 2 ) 按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字,也可记录为1.09. 9乘以10的指数幕形式。报告每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数量,单
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- GB 26425 2010 饲料 中产 荚膜 检测
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