1、ICS 65. 120 B 46 道写中华人民11: 不日国国家标准G/T 26425-2010 饲料中产气芙膜梭菌的检测Method for determination of Clostridium per fringens in feeds (ISO 7937: 2004 , Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the enumeration of Clostridium户er斤lngens-Colony-count technique, MOD) 2011-01-14发布数码防伪中华人民
2、共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2011-07-01实施发布中华人民共和国国家标准饲料中产气英膜梭菌的检测GB/T 26425-2010 * 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤开本880X 1230 1/16 印张1字数24千字2011年5月第一版2011年5月第一次印刷* 书号:155066. 1-41957定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 26425-2010 目。
3、吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准使用重新起草法修改采用ISO7937: 2004(食品和动物饲料的微生物学产气英膜梭菌计数的水平方法菌落计数技术)(英文版。本标准与ISO7937 :2004相比在结构上有较多调整，附录B中列出了本标准与ISO7937: 2004的章条编号对照一览表。本标准与ISO7937 :2004相比存在技术性差异，这些差异涉及的条款已通过在其外侧页边空白位置的垂直单线(I )进行了标识，附录C中给出了相应技术性差异及其原因的一览表。本标准还做了下列编辑性修改:一一删除了ISO7937: 2004的目次;删除了ISO7937: 2004的引言;删
4、除了ISO7937: 2004的参考文献。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。本标准起草单位:广东省微生物分析检测中心。本标准主要起草人:朱红惠、孙晓棠、羊宋贞、陈远良、张鲜妓。I GB/T 26425-2010 饲料中产气英膜梭菌的检测1 范围本标准规定了饲料中产气英膜梭菌的检验方法。本标准适用于饲料中产气英膜梭菌的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 14699
5、. 1饲料采样(GB/T14699.1-2005 , ISO 6497:2002 , IDT) GB/T 20195动物饲料试样的制备(GB/T20195-2006 , ISO 6498:1998 ,IDT) SN/T 1538. 1-2005 培养基制备指南第1部分z实验室培养基制备质量保证通则(SN/T 1538.1-2005,ISO/TS 11133-1:2000,MOD) SN/T 1538. 2-2007培养基制备指南第2部分z培养基性能测试实用指南(SN/T1538. 2 2007 ,ISO/TS 11133-2 :2003 ,MOD) 3 原理3. 1 在平板中接种特定量待测液体
6、样品，或特定量其他类型待测样品初始悬液。在相同条件下接种待测样品或初始悬液的十倍梯度稀释物。浇注一层选择性培养基，凝固后再浇注一层此培养基覆盖。3.2 平板于37oc厌氧培养20h土2h。3.3 典型菌落计数。3.4 典型菌落的数量用确证试验证实，进一步计算每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数。4 稀释液、培养基及试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸锢水或去离子水，或相当纯度的水。4. 1 蛋白陈生理盐水稀释液:参见附录A中的A.L4.2 亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(SC):参见附录A中的A.20注:该培养基原称为无卵黄膝蛋白陈-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂CTSC)。4.3
7、 液体硫乙醇酸盐培养基:参见附录A中的A.3。4.4 乳糖亚硫酸盐(LS)培养基(可选):参见附录A中的A.4。4.5 动力硝酸盐培养基(可选):参见附录A中的A.5。4.6 硝酸盐还原试剂(可选):参见附录A中的A.6。4. 7 钵粉(可选):可选。4.8 乳糖-明胶培养基(可选):参见附录A中的A.7。1 GB/T 26425-2010 5 设备和玻璃器皿需配备微生物学常规设备和以下设备及玻璃器皿。5. 1 干热灭菌烘箱或湿热高压灭菌锅。5.2 恒温培养箱:37.C士1.C。5.3 厌氧培养装置或厌氧罐。5.4 pH计:精度到士O.1个单位。5.5 接种环、穿刺接种针z铅金丝或镰丝，一次性
8、使用的无菌用品亦可，接种环直径约3mm. 5.6 过滤除菌装置:用于溶液过滤除菌。5. 7 试管、锥形瓶、倒管:容积适当，试管16mmX160 mm. 5.8 吸管:1mL(具0.1mL刻度)，10 mL(具0.5mL刻度。5.9 玻璃或塑料平板z直径9cm10 cm. 5.10 水浴锅:46.C士O.5 .C , 44 .C 4 7 .C可调。5. 11 橡胶吸耳球:必要时与具刻度的移液管一同用于配制硝酸盐还原试剂。6 采样实验室样品真实、具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的。样品送到微生物检验室应越快越好。采样数量和方式按照GB/T14699. 1执行
9、。7 样品的制备按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应尽快检验。8 操作步骤8. 1 检样制备、初始悬液和十倍稀释以元菌操作称取试样25g(mL)加入225mL蛋白陈生理盐水稀释液(4.1)，均质1min2 min，制成1: 10的稀释液。吸取1: 10的稀释液1mL，加入9mL蛋白陈生理盐水稀释液，经充分混匀后制成1: 100的稀释液。更高稀释度可按此方法操作。8.2 接种和培养用元菌移液管吸取1mL初始悬液(若样品本身为液体，则直接吸取样液)加入到灭菌空平皿中央，每个样品做两个重复，每个平板挠注44.C47 .C水浴保温的SC培养基(4.2)10 mL15 mL，柔和转动平板，
10、使稀释液与培养基充分混匀。培养基凝固后，再于其上浇注10mL的SC培养基，待其凝固后，将平板倒置于庆氧培养装置(5.3)内，37.C厌氧培养20h士2h。培养时间不宜过长，否则会导致平板过度黑化。采用同样操作步骤进行1: 100的稀释物的接种和培养，必要时可采用同样操作步骤进行更高适宜稀释物的接种和培养。8.3 计数及菌落筛选培养后，选择长有150个菌落以下的平板，最好选择连续稀释度的平板，计数每皿中黑色菌落。然2 后从中选出5个黑色菌落用8.4.1或8.4.2中的任一种方法做确证试验。8.4 确证试验8.4.1 用LS培养基进行确证试验GB/T 26425-2010 注2因只有产气英膜梭菌和
11、不和谐梭茵(Clostrid i um absonum)这两种菌能在LS培养基(4.4)上46.C培养下生长，故采用此法进行确证试验不帘确保从SC培养基上选出的黑色菌落为纯培养即可转接至液体硫乙醇酸盐培养基进而转接到LS培养基上。8.4. 1. 1 培养及转种将每个选出的菌落接种至液体硫乙醇酸盐培养基(4.3)，37.C厌氧培养18h24 h后，立即用灭菌移液管将5滴液体硫乙醇酸盐培养物转接到LS培养基中，水浴(5.10)中46.C需氧培养18h24 h。8.4. 1. 2 鉴别检查LS培养基中的倒管是否产气且是否呈黑色(为亚硫酸铁沉淀)，LS培养基变黑且产气超过1/4小倒管的可确认为阳性;若
12、LS培养基变黑但产气不足1/4小倒管的，立即从中转接5滴至另一管LS培养基，于水浴中46.C培养18h24 h后，同上判断是否阳性。在SC培养基上形成特征性菌落，且用LS培养基确认为阳性的可认定为产气英膜梭菌，其他情况均应判为阴性。8.4.2 用动力硝酸盐培养基和乳糖-明胶培养基进行确证试验8.4.2. 1 概述用此法进行确证需确保用于确证的菌落得到良好分离。平板表面出现过度生长或不可能选出良好分离的特征菌落时，应将5个特征菌落接种至预脱气的液体硫乙薛酸盐培养基，37.C庆氧培养18h 24 h后，划线于SC基础琼脂平板(A.2.1)上，待划线干后，再覆盖10mL SC基础琼脂，凝固后置37.
13、C厌氧培养18h24 h后，从每一平板中选取至少1个良好分离的特征菌落，必要时重复于SC基础琼脂上划线及培养，直至获得良好分离的黑色菌落。再如8.4.2.2，8.4.2.3和8.4.2.4所述进行确证试验。8.4.2.2 动力硝酸盐培养基确证将选出的菌落穿剌接种至新鲜脱气的动力硝酸盐培养基(4.5),37 .C厌氧培养24h，观察接种线的生长情况，沿接种线周围呈扩散生长的为有动力，然后用有刻度的滴管和橡胶吸耳球滴加硝酸盐还原试剂(4.6)0.2 mLO. 5 mL，观察硝酸盐是否被还原，变红的为阳性。若15min内无红色产生，加少量钵粉10min后观察结果，此时若变红则表明元硝酸盐被还原，判为
14、阴性。产气英膜梭菌元动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。警告:为了安全起见，滴加硝酸盐还原试剂应在通风榻中进行。8.4.2.3 转种及乳糖，明胶培养基确证试验将选出的菌落穿剌接种至新鲜脱气的乳糖-明肢培养基(4.肘，37.C厌氧培养24h，观察是否发酵乳糖，发酵乳糖者产气且变黄(因产酸), 5 .C放置1h，据其是否凝固检查明肢液化与否。此培养基凝固者，接着再培养24h，以检查明胶液化与否。8.4.2.4 鉴别SC培养基上形成黑色菌落，元动力，能还原硝酸盐，发酵乳糖产酸产气，48h内液化明胶者可判为3 G/T 26425-2010 产气英膜梭菌。产气英膜梭菌的硝酸盐还原反应迅速且强烈，仅有微弱硝酸
15、盐还原反应(如变成挑红色)者，应排除。9 结果计算与报告9. 1 每个平板中产气英膜梭菌的数量每个平板中产气英膜梭菌菌落数a的计算见式(1): a=去xC式中za一一每块平板上的产气英膜梭菌菌落数;b一挑取后经证实为产气英膜梭菌的菌落数;A一一一挑取平板上用于验证的菌落数;C一一平板上的所有特征菌落数。最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。示例:若某板上长有30个典型菌辘，从中选出做确证试验的5个菌中有4个证实为产气英膜梭菌，则=a=f 30=24 9.2 试样中产气英膜梭茵茵数的计算方法与报告9.2. 1 通常情况下试样中产气英膜梭菌菌敬的计算方法与报告. ( 1 ) 选择两个
16、连续稀释度平板(其上经确证后的产气英膜梭菌数介于15150之间)，按式(2)计算1 mL或1g试样中的产气英膜梭菌菌数N.式中zN=_ L; a 一-V(nj + o. lnz)d N一一样品中产气英膜梭菌菌落数;L;a一一一所有平板经确证后的产气英膜梭菌菌落数的总和zV一一平板的接种体积，单位为毫升(mL);nj一一第一个稀释度的平板数;nz一一第二个稀释度的平板数;d 一一第一个稀释度的稀释因子未经稀释的液体样品的d值为1)。( 2 ) 按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，也可记录为1.09. 9乘以10的指数幕形式。报告每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数量，单
17、位为CFU/g(mL)。示例，: 若第一个稀释度。0-2)经确证后的菌落数为168和215，第二个稀释度(10经确证后的菌落数为14和15，则:N = 168 + 215 + 14 + 15 =. 42 叫咱n一一1X (2 + O. 1 X 2) X 10-2一0.022-v U 报告每毫升或每克试样中含产气英膜梭菌数盐为1.9X10CFU!g(mL)或19000CFU!g(rnL)。示例2:只有一个稀释度平板上含少于150个确证为产气英膜梭菌菌落数，如最后一稀释液(10-)经证实含产气英膜梭茵茵落数分别为120和130，则zGB/T 26425-2010 N = _ 120_+ 130.
18、= . 250 =一一一一一一=一一一一=1 250 000 1 X 2 X 10 0.000 2 报告每毫升或每克试样中含产气英膜梭菌数量为1.2 X 10 CFU/g(mL)或1200 000 CFU/g(mL)。9.2.2 经确证后的产气英膜棱菌菌数很少的情况下的计算方法与报告9.2.2. 1 仅液体测试样品原班或其他样品的初始悬液证实含产气英膜梭菌，且均少于15仅液体测试样品原液或其他样品的初始悬液证实含产气英膜梭菌，且均少于15时，按式(3)计算1 mL或1g样品中的产气英膜梭菌数Neo式中zNe 样品中产气英膜梭菌菌数;Ne=三至2Vd a 两个被选择平板中经确证后的产气英膜梭菌菌
19、落数的总和EV 一一平板的接种体积，单位为毫升(mL);d 一一一稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的d值为1)。报告每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数量。示9tJ1 : 某固体样品初始悬液的菌落数分别为8和6，则:Ne = _8十614句一一-一一，一1X 2 X 10-1 -0.2一，报告每克试中学中含产气英膜梭菌菌数为70CFU/g. 9.2.2.2 液体现试样晶原班或其他样晶的初始悬遭经确证后不含产气英膜棱菌. ( 3 ) 报告每毫升或每克试样中产气英膜梭菌数量小于l/d(d为液体测试样品原破或其他样品的初始悬液的稀释因子，未经稀释的液体样品d值为1)。5 G/T 26425-2010
20、 .1 蛋白膜生理盐水. 1. 1 成分醋蛋白陈氧化铀蒸锢水. 1.2 制法1. 0g 8.5 g 1 000 mL 附录A(资料性附录)培养基和试剂溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在25oc时为7.0士0.20.2 亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(SC).2.1 基础培养基. 2. 1. 1 成分蛋白陈15.0 g 大豆蛋白陈5.0 g 酵母粉5.0 g 偏重亚硫酸铀(Na2S20S)1. 0 g 拧棱酸铁镣1)1. 0g 琼脂9. 0 g18. 0 g2) 蒸馆水1 000 mL . 2. 1. 2 制法各成分加热溶解，调整pH值，使培养基pH值在25oc时为7.6:!:O
21、. 2，分装，121oc灭菌15min, 5 oc士3oc最多可保存2周。某些情况下(见8.4.2.1) ，可能应制备SC琼脂基础培养基平板用于动力硝酸盐培养基和乳糖-明胶培养基确证试验，因此，将约15mL基础培养基挠注平板(水浴融解后冷却至约44oc 47 OC)，使之凝固。平板干燥后立即使用。. 2. 2 D-环丝氨酸溶擅. 2. 2.1 成分D-环丝氨酸3)4.0 g 1) 此试剂含铁质量分数应不少于15%。2) 据凝胶强度而定。3) 仅能使用白色结晶粉末。6 GB/T 26425-2010 蒸锢水100 mL A.2.2.2 制法D-环丝氨酸溶于蒸锢水，过滤除菌。3oc士2oc最多可保
22、存4周。A.2.3 完全培养基临用前，每100mL灭菌的基础培养基(A.2. 1)冷却至约440C470C后，加入1mLD-环丝氨酸溶液(A.2. 2)，立即挠注平板。A. 2. 4 SC培养基质量保证和性能测试选择性和生长率试验，见SN/T1538. 1-2005。性能测试见SN/T1538. 2-2007中的表B.1见TS(C)。A.3 波体硫乙醇酸盐培养基A. 3.1 成分酷蛋白陈L-眈氨酸D葡萄糖酵母粉氯化铀硫代乙醇酸铀琼脂刃天青蒸馆水A.3.2 制法15.0 g o. 5 g 5.5 g 5.0 g 2.5 g 0.5 g O. 5 g2. 0 g41 0.001 g 1 000 m
23、L 加热溶解各成分，调整pH值，使培养基pH值在25oc时为7.1士0.2，分装每管10mL, 121 oC高压灭菌15min。使用前需脱气。A.3.3 液体硫Z醇酸盐培养基质量保证和性能测试选择性及生长率测定见SN/T1538. 1-2005 0性能测试见SN/T1538.2-2007中的表B.4。A.4 乳糖亚磺酸盐(LS)培养基(可选)A. 4.1 基础培养基A. 4. 1. 1 成分醋蛋白陈酵母粉氯化铀乳糖4) 据琼脂凝胶强度而定。5.0 g 2.5 g 2.5 g 10.0 g 7 GB/T 26425-2010 L-半脱氨酸盐酸盐蒸锢水A. 4. 1. 2 制法0.3 g 1 00
24、0 mL 溶解各成分(必要时可煮沸溶解。调整pH值，使培养基pH值在25.C时为7.1士0.2.分装至带有小倒管CDurham小管)的试管中，每管8mL,121 .C高压灭菌15min. 3 .C士2.C最多可保存4周。A.4.2 焦亚硫酸铀溶液A. 4. 2.1 成分无水焦亚硫酸铀CNa2S205)1. 2 g 蒸馆水100 mL A. 4. 2. 2 制法将焦亚硫酸铀溶于蒸馆水中，过滤除菌。此溶液仅可当天使用。A.4.3 拧穰酸铁按溶液A. 4. 3.1 成分拧攘酸铁钱蒸锢水A.4.3.2 1 g 100 mL 将拧棱酸铁镀溶于蒸锚水中，过滤除菌。此溶液仅可当天使用。A.4.4 完全培养基
25、培养基若非当天使用，临用前需迅速加热并冷却使之脱气。若培养基装于螺旋盖的瓶中，加热前松开瓶盖，冷却前则拧紧瓶盖。加焦亚硫酸铀禧液CA.4. 2)和拧朦酸铁镀溶液CA.4. 3)各0.5mL至8 mL的基础培养基CA.4.1)中。完全培养基应当天使用。A.5 动力硝酸盐培养基(可选)A. 5.1 成分酷蛋白陈牛肉音半乳糖甘油8 硝酸饵CKN03)磷酸氢二铀CNa2HP04)琼脂蒸悔水5) 据琼脂凝胶强度而定，5.0 g 3.0 g 5.0 g 5.0 g 1. 0g 2.5 g 1. 0 g5. 0 g5) 1000 mL GB/T 26425-2010 A.5.2 制法加热溶解，调整pH值，使
26、培养基pH值在25C时为7.3土0.2，分装，每管10mL , 121 c高压灭菌15 min。培养基若非当天使用，于5C士3C保存，临用前水浴或蒸汽浴中加热15min后迅速冷却至培养温度使之脱气。5C土3C最多可保存4周。A.6 硝酸盐还原试剂(可选)A.6. 1 5-氨基-2-荼磺酸(5-2-ANSA)溶液将5-氨基-2-荼磺酸0.1g溶解于15%(体积分数)的乙酸溶液100mL中，滤纸过滤，贮存于带塞棕色瓶中(最好具球形滴器)，5C :i: 3 c贮存。A.6.2 磺腰酸溶液将磺胶酸0.4g溶于15%(体积分数)的乙酸溶液100mL中，滤纸过滤，贮存于带塞棕色瓶中(最好具球形滴器),5
27、c士3c贮存。A.6.3 完全试剂的用法临用前等比例混合以上两种溶液(A.6.1及A.6. 2)，多余试剂弃去。A.7 乳糖-明股培养基(可选)A.7.1 成分酷蛋白陈酵母粉乳糖明胶酣红蒸馆水A.7.2 制法15.0 g 10.0 g 10.0 g 120.0 g 0.05 g 1000 mL 除乳糖和酣红外，溶解其余各成分，调整pH值，使培养基pH值在25C时为7.5土0.2，加乳糖和酣红，分装，每管10mL, 121 C高压灭菌15min，若当天不用，于5C士3c保存。过期弃去。临用前，于沸水或流动蒸汽中加热15min，然后迅速冷却至培养温度。5C土3C最多可保存3周。9 GB/T 264
28、25-2010 10 附录B(资料性附录)本标准与ISO7937 :2004相比的结构变化情况本标准与IS07937: 2004相比在结构上有较多调整，具体章条编号对照情况见表B.L表B.l本标准与ISO7937: 2004的章条编号对照情况本标准章条编号对应的国际标准章条编号9.1-9.2 10.1 10.2 11 附录A5 A.1 5. 1 A. 2 5.2 A. 2. 1-A. 2. 4 5.2.1-5.2.4 A. 3 5.3 A. 3.1-A. 3. 3 5.3.1-5.3.3 A.4 5.4 A. 4.1-A. 4. 4 5.4.1-5.4.4 A. 5 5.5 A. 5.1-A.
29、 5. 2 5.5.1-5.5.2 A. 6 5.6 A. 6.1-A. 6.3 5.6.1-5.6.3 A.7 5.8 A. 7. 1-A. 7. 2 5.8.1-5.8.2 A. 7 5.8 附录B附录C附录AGB/T 26425-2010 附录C(资料性附录)本标准与ISO7937 :2004的技术性差异及其原因表C.l给出了本标准与ISO7937: 2004的技术性差异及其原因。表C.1本标准与ISO7937: 2004的技术性差异及其原因本标准章条编号技术性差异原因1 删除IS07937: 2004范围中适用于食品以及食品生产和食品本标准只针对饲料处理过程中环境样品关于规范性引用文件
30、，本标准做了具有技术性差异的调整，调整的情况集中反映在第2章规范性引用文件中，具体调整如下z一一删除IS06887-1; 删除IS06887-2; 一一删除IS06887-3; 删除的国际标准元对应的一一删除IS06887-4; 一一删除IS07218; 国内标准，为便于标准使用者2 一一删除IS08261; 使用，本标准将这些内容直接用修改采用国际标准的SN/T1538. 1-2005，代替了列出纳入本标准中;引用IS0/TS 11133-1; SN/T 1538，便于标准使用者一一用修改采用国际标准的SN/T1538. 2-2007，代替了使用中文术语IS0/TS 11133-2 :200
31、3; 一一增加引用了GB/T8170; 一一增加引用了GB/T14699. 1; 一一增加引用了GB/T20195 4 只列出了培养基及试剂名称，将成分及配制方法转至附录A中按GB/T20000. 1要求，与我国标准版式保持一致将IS07937 :2004中采样按照相应的国际标准执行，如果没有6 标准可按双方达成的一致意见执行，改为按照国内标准我国饲料采样有标准GB/T 14699. 1执行将IS07937: 2004中试样的制备按照相应的国际标准执行，如7 果没有标准可按双方达成的一致意见执行，改为按照国内标准便于标准使用者使用GB/T 20195执行8.1 将IS07937: 2004中引
32、用的IS06887相关内容列出，纳入本标便于标准使用者使用准中9 将IS07937 :2004中引用的IS07218相关内容列出，纳入本标便于标准使用者使用准中删除IS07937: 2004中3术语和定义的内容按GB/T20000. 1要求，与我国标准版式保持一致删除IS07937 :2004中10.2精密度的内容按GB/T20000. 1要求，与我国标准版式保持一致OFON-mN寸NH阁。GB/T 26425-2010 表C.1(续)本标准章条编号技术性差异原因删除IS07937 :2004中第11章检测报告要求检测报告应当注明所使用的检测方法、培养温度及其结果。还需要提及在本标准按GB/T
33、20000. 1要求，与中未涉及的所有操作步骤细节或所有可选步骤以及所有可能影响最终结果的细节。检测报告应当包含对完成检测样品的所有我国标准版式保持一致必要的信息。按GB/T20000. 1要求，与附录A将培养基和试剂成分及配制方法由IS07937 :2004中第5章转我国标准版式保持一致，此内至本标准附录A中容属资料性内容，宜安排在标准附录中删除IS07937 :2004中附录A(资料性附录)实验室间比对试按GB/T20000. 1要求，与验数据我国标准版式保持一致删除参考文献按GB/T20000. 1要求，与我国标准版式保持一致侵权必究书号:155066.1-41957 定价:* 版权专有18.007巳GB/T 26425-2010 打印日期:2011年5月19日F002A
