GB T 13091-2002 饲料中沙门氏菌的检测方法.pdf
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1、ICS 07.100.30 B 46 GB 中华人民共和国国家标准G/T 13091- 2002 代替GB/T13091-1991 饲料中沙门氏菌的检测方法Determination of Salmonella in feeds (lSO 6579: 1993 ,Microbiology-General guidance on methods for the detection of Salmonella ,MOD) 2002- 09-24发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2003 - 03 -01实施发布050928075217 中华人民共和国国家标准饲料中沙门氏菌的检测方法GB/T
2、 13091-2002 峙中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售4峰开本880X12301/16 印张lX字数34千字2003年4月第一版2003年4月第一次印刷印数1-1500 峙书号:155066. 1-19203 定价13.00元网址晤科目634-493版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533G/T 130912002 前言本标准代替GB/T13091 1991(饲料中沙门氏菌的检验方法,因为国际上的发展原标准在技术上已过时。本标准修改采用
3、ISO6579:1993(微生物学沙门氏菌检验导则(英文版)。本标准根据ISO6579:1993重新起草。除增加了资料性附录D、附录E外,本国家标准章条编号与ISO 6579:1993完全一样。考虑到我国国情,在采用ISO6579:1993时,本标准做了一些修改。有关技术性差异己编入正文中并在它们所涉及的条款的页边空白处用垂直单线标识。在附录E给出了这些技术性差异及其原因的一览表以供参考。为便于使用,本标准还做了以下编辑性修改:a) 本国际标准一词改为本标准气b)用小数点代替作为小数点的逗号C)删除国际标准的前言;d)标准名称由微生物学沙门氏菌检验导则改为饲料中沙门民菌的检测方法。本标准的附录
4、A、附录B、附录C为规范性附录,附录D、附录E为资料性附录。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(北京)。本标准主要起草人:饶正华、李丽蓓、高生、杨曙明、苏晓鸥。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:GB/T13091199L G/ T 13091 - 2002 饲料中沙门氏菌的检测方法警告:为保障实验室人员的健康,只有具备适当设备的实验室才能承担沙门氏菌检验。应小心处理所有培养材料的废弃物。范围本标准适用于饲料中沙, 2 规范性引用文件3 下列术语3. 1 4 原理注:样品中可能存在少量自确监受伤的沙门氏
5、菌,常:羞得如曾菌。4. 1 用非选择性液体培养基预增4.2 在选择性液体培养基上增菌将4.1中的培养物接种到氯化镇-孔雀绿培养基和亚晒酸盐脱氨酸培养基中。氯化镜-孔雀绿培养基在42C培养24h,亚晒酸盐脱氨酸培养基在36C :l: 1 C培养24h或再延长24 h。4. 3 划线及识别将4.2的培养物接种到以下两个选择性培养基:应使用酣红煌绿琼脂培养基,除非国际标准对检样有规定或有特殊考虑(如分离乳糖阳性沙门氏菌)。GB/T 13091一2002一-DHL琼脂培养基(见5.2.4.2)。在36CC士1C培养,24h后检查,必要时培养至48h,根据菌落特性,辨别可疑菌落。4.4 鉴定挑出4.3
6、中的可疑沙门氏菌菌落,再次培养,用合适的生化和血清学试验进行鉴定。5 培养基、试剂和血清5. 1 总则微生物实验室的操作,按照GB4789.1进行。5.2 培养基和试剂注:由于有大量的培养基和试剂可供选择,为明确起见,在附录B中规定了它们的成分和制备方法。除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。5.2. 1 缓冲蛋白陈水(BP):见第B.1章。5.2.2 氯化镜-孔雀绿增菌液(RV):见第B.2章。5.2.3 亚晒酸盐胧氨酸增菌液(SO:见第B.3章。5.2.4 选择性划线固体培养基:a) 酣红、煌绿琼脂:见第B.4章和附录C。b) DHL琼脂:见第B.5章。
7、5.2.5 营养琼脂:见第B.6章。5.2.6 兰糖铁琼脂(TSl):见第B.7章。5.2.7 尿素琼脂:见第B.8章。5.2.8 赖氨酸脱竣试验培养基:见第B.9章。5.2.9 日半乳糖昔酶试剂:见第B.12章。5.2.10 V-P反应培养基(见第B.10章): a) V-P培养基。b) 肌酸溶液。c) -荼酣乙醇溶液。d) 氢氧化饵溶液。5.2.11 肯定基质反应培养基(见第B.11章): a) 膜蛋白陈色氨酸培养基。b) 柯凡克试剂。5.2. 12 半固体营养琼脂:见第B.13章。5.2.13 盐水溶液:见第B.14章。5. 2. 14 沙门氏菌因子0,叭,H型血清。6 设备与材料注3:
8、可以用一次性使用的仪器代替可重复使用的仪器。6.1 高压灭菌锅或灭菌箱。6.2 干热灭菌箱:37C士1C55cC士lC。6. 3 培养箱:36C士1C。6.4 42 C士1C,j(浴或42C士0.5C培养箱。6. 5 水浴:45C士1cC ,55 C士1cC ,70 C士1C 0 6. 6 水浴:36C土1C。6. 7 接种环:铀钝或镰铅丝,直径约3mmo 2 6.8 pH 仪。6.9 培养瓶或三角瓶。注:可用无毒金属或塑料螺丝盖的培养瓶或三角瓶。6.10 培养试管:直径8mm,长度160mm。6. 11 量筒。6.12 刻度吸管。6.13 平皿:皿底直径9cm或14mm。7 采样GB/T 1
9、3091-2002 实验室样品真实、具有代表性,在运输和贮存过程中没有发生损失或改变是非常重要的。采样方法可按照国家标准GB/T14699. 1进行(器具要经过消毒)。8 试样的制备将至少2kg具有代表性的饲料样品,四分法缩分至约250g,过40目筛,在密闭瓶中低温保存。9 操作步骤(见附录A)9. 1 试料和1: 10稀释班制备9.1.1 用预增菌被(5.2.1)作为稀释液,来制备1: 10稀释液。9.1.2 取试料25g,加入装有225mL缓冲蛋白陈水(5.2.1)的500mL广口瓶内。如果试料量不是25 g,试料质量与预增菌攘的体积比应约为1: 10。注1:当检测来自同一特定样品的多个试
10、料时,若有证据表明试料混合不影响检验结果,试料可以混合。例如:若需检测10份25g试料时,混合这10份,形成250g试料,缓冲蛋白陈水用2250L。或者从10个单独的试料预增菌液中分别取出0.1mL和10mL入RV培养基和亚砸酸盐脱氨酸增菌液中,混合后分别接入0.1L和1L 选择性增菌培养基中。注2:干样和粉状样可能需要特殊的水合过程以提高沙门氏菌的复性。9.2 非选择性增菌将增菌液在36C土1C培养,时间不少于16h,不超过20ho 9. 3 选择性增菌培养9.3.1 取9.2中获得的预增菌培养物0.1mL,接种于装有10mL氯化娱叩孔雀绿增菌液(5.2.2)的试管中,另取预增菌培养物10m
11、L,接种于装有100mL亚晒酸盐脱氨酸增菌液(5.2.3)培养瓶中。9. 3. 2 接种后两种培养基(9.3.1)的培养条件如下:a) 氯化娱孔雀绿增菌液试管在42C培养24h。b) 亚晒酸盐脱氨酸培养瓶在36C土1C培养24h或48h。注:在某些情况下,可以将亚硝酸盐脱氨酸培养基的培养温度增加至42C。但需在检验报告中提及此改动。9.4 分离培养和鉴定9.4.1 氧化镜孔雀绿增菌液在培养24h后,分别用接种环划线接种在酣红煌绿琼脂(5.2.4a)J平皿和DHL琼脂(5.2.4b)J平皿上,为取得明显的单个菌落,取一环培养物,接种两个平1ill.,第一个平皿接种后,连续在第二个平皿上划线接种。
12、注:在盼红煌绿琼脂平板上划线时,建议使用以下方法:两个平皿用同一接种环(6.7);按附录D进行划线操作;如l完整个平皿g第一个平皿接种后,不要烧接种环.也不要换接种环。当仅用一个平皿时,划线方法按附录D中的第一个平皿的方法。9.4.2 亚晒酸盐脱氨酸培养瓶在培养24h后,重复9.4.1的操作。9.4.3 将(9.4.1)和(9.4.2)的平皿底部向上,在36C士1C培养箱中培养。9.4.4 亚晒酸盐脱氨酸培养基(9.3.2和9.4.3)在培养48h后,重复9.4.2和9.4.3。GB/ T 13091 - 2002 9.4.5 培养20h24 h后,检查平皿(9.4.3和9.4.4)中是否出现
13、沙门氏菌典型菌落,生长在酣红煌绿琼脂上的沙门氏菌典型菌落,使培养基颜色由粉红变红。9.4.6 如生长微弱,或无典型沙门氏菌落出现时,可在36C士1C重新培养18h24 h。再检验平皿是否有典型沙门氏菌菌落。注:任何典型或可疑菌落均应进行鉴定(9.5)。辨认沙门氏茵茵落.在很大程度上依靠经验,它们外表各有不同,不仅是种与种之间,每批培养基之间也有不同,此时,可用沙门氏菌多价因子血清,先与菌落作凝集反应,以帮助辨别可疑菌落。9. 4.7 在进行沙门氏菌鉴定时,可以使用商业鉴定材料。9. 5 鉴定9.5.1 鉴定菌落的选择从每种分离平皿培养基上(9.或可疑菌落供进行鉴定。挑选的菌落在营养琼月化和血清
14、鉴定。9. 5. 2 生化鉴定将按9.5.1挑选9. 5. 2.1 三糖铁培在琼脂斜面上琼脂斜变黑)。当分离到乳糖阳性养的结果(9.5.3)。9. 5. 2. 2 尿素琼脂培养基(5.在琼脂表面划线,在36CC士红的颜色变成玫瑰红色至桃红色,以9.5. 2.3 L赖氨酸脱殷反应培养基(5.2.8)落。少于5个时,可将全部典型24 h.用纯培养物作生仅仅限于三糖铁培,尿素极快地释放氨,它使酣将培养物刚好接种在液体表面之下,在36C:J:1 C培养24h.生长后产生紫色,表明是阳性反应。9.5. 2.4 检查卢半乳糖昔酶的反应(5.2.9)取一接种环可疑菌落,悬浮于装有0.25mL生理盐水的试管中
15、,加甲苯I滴,振摇混匀,将试管在36 C士1C水浴锅中放置数分钟,加ONPG试液0.25mL.将试管重新放入36C :J: 1 C水浴锅中24h.随时检查,黄色表明为阳性反应,反应常在20min后明显出现。9.5.2.5 v-P反应培养基(5.2.10)挑取一环可疑菌落,接种在v-P反应培养基C5.2. 10 a)J上,在36C士lC培养24h.取培养物0. 2 mL于灭菌试管中,加肌酸榕液C5.2. 10 b)J2滴,充分泪匀后加-茶酣乙醇C5.2.10 c)J溶被3滴,GB/ T 13091 - 2002 充分棍匀后再加氢氧化押溶液(5.2.10d)J2滴,再充分振摇泪匀,在15min内,
16、形成桃红色,表明为阳性反应。9. 5. 2. 6 能基质反应培养基(5.2.11)取可疑菌落,接种于装有5mL膜蛋白陈色氨酸培养基(5.2.11a)J的试管中,在36C:!:1 C培养24 h,培养结束后,加柯凡克试剂(5.2.11b)J1 mL,形成红色,表明是阳性反应。9. 5. 2. 7 生化试验生化试验见表2。可疑菌在培养基上的反应三糖铁葡萄糖形成酸二糖铁葡萄糖产气a Salmonella c Salmonella 以纯培养菌落(9.9. 5. 3. 1 除去能自凝的在仔细擦净的玻璃板动30s60s,对着黑的背提供作抗原鉴定。9.5. 3. 2 0抗原检查用认为无自凝力的纯菌落,按9.
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