1、ICS 65.020.01 B 16 道国和国国家标准11: -、中华人民G/T 28064-2011 蚕豆染色病毒检疫鉴定方法Detection and identification of broad bean stain virus 2011-12-30发布2012-06-01实施数码防伪/ 中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准蚕豆染色病毒检瘦鉴定方法GB/T 28064-2011 * 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中
2、心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销祷开本880X12301/16 印张0.75字数17千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷每-I号:155066. 1-11584定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28064-2011 剧吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国
3、深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人:陈红运、陈青、林石明、郑耘、赵文军、李一农、廖富荣、余芳平、朱水芳、陈枝楠。I G/T 28064-2011 蚕豆染色病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了蚕豆染色病毒的血清学和分子检测方法。本标准适用于蚕豆Viciafaba、小扁豆Lensculinaris、豌豆Pisumsativum和菜豆Phaseolusvulgaris种子携带蚕豆染色病毒的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 2122 进出境
4、植物及植物产品检疫抽样3 蚕豆染色病毒基本信息中文名:蚕豆染色病毒。学名:broad bean stain viruso 缩写:BBSV。属虹豆花叶病毒科Comoviridae;旺豆花叶病毒属Comovirus。病株花粉可通过授粉将病毒传至健株种子;远距离通过种子传播，种传寄主有蚕豆(种传率4%16%)、豌豆(20%)和小扁豆(0.2% 32. 4%) 0 BBSV易机械接种传播，并可通过甲虫传毒，豆长朦象甲Apionvorax是最主要的传毒介体。蚕豆染色病毒的其他信息参见附录A。4 方法原理主要根据BBSV的血清学特性和基因组特征进行鉴定，生物学测定为辅助鉴定手段。5 仪器、设施及试剂5.
5、1 仪器与设施酶联检测仪、电子天平(感量0.0001 g)、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等;微量移液器(2.5L，10L，20L，100L，200L，1000L) ;酶联板、研钵等;防虫温室。5.2 试剂酶联免疫吸附测定试剂(见附录B)、RT-PCR检测试剂(见附录。G/T 28064-2011 6 检测与鉴定6. 1 抽样按照SN/T2122的规定执行。6.2 制样选取种皮呈BBSV为害症状的可疑病粒，无可疑病粒时随机选取。用元菌水浸种16h，磁盘中放入两层吸满水的滤纸，将充分吸水的种子摆放在滤纸上，20.C催芽，芽长2cm4 cm时取芽进行
6、检测。检测方法见6.3。注:资源性引种时，每份资源选10粒-14粒种子播种于防虫温室或网室内，待长出4片-6片叶时挑选有病毒症状植株的叶片进行检测。6.3 检测6.3. 1 酶联免疫眼附测定双抗体夹心法见附录B.6. 3. 2 RT-PR检测称取O.1 g植物组织提取总RNA，沉淀充分干燥后溶于30LDEPC处理的去离子水中。RT-PCR检恻方法见附录CQ6.3.3 生物学测定生物学测定参见附录D。7 结果判定与记录7. 1 结果判定酶联测定为阳性后，RT-PCR检测结果呈阴性或者鉴别寄主反应与附录D描述不符合，判定未检出蚕豆染色病毒。酶联测定为阳性后，RT-PCR检测结果呈阳性或者鉴别寄主反
7、应与附录D描述相符合，判定检出蚕豆染色病毒。直接对样品进行RT-PCR检测时，检测结果呈阳性即可判定检出蚕豆染色病毒。7.2 结果记录记录包括:样品来源、种类、取样人员、原始记录和检测结果等。酶联测定应有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测应有电泳结果图片，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。8 样品保存经检验确定携带蚕豆染色病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4.C，病株在一20.C或者一80.C冰箱中保存，做好标记和登记工作。2 GB/T 28064-2011 附录A(资料性附录)蚕豆染色病毒寄主、分布及危害症状A.1 寄主范围BBSV侵染7种豆科植物:美丽猪屎豆(Crotalari
8、aspectabilis)、毛羽扇豆(LuPinushirsutus)、白花草木犀(Melilotusalba )、菜豆、豌豆、蜂车轴草(Trifol叩mincarnatum)和蚕豆。A.2 病害症状A. 2.1 蚕豆蚕豆感染BBSV后，症状分为花叶型和坏死型。花叶型表现为接种叶片上有或元局部斑，新叶均呈褪绿条纹状、环状和块状花叶片上出现褪绿斑驳和花叶症状;坏死型表现为接种叶片有或元黄化或局部斑，叶脉和茎出现坏死条纹，最后茎坏死、顶枯、全株萎焉。种子表皮出现褐色坏死色斑。A.2.2 豌豆豌豆感染BBSV后，症状分为花叶型、顶枯型和花叶、顶枯混合型。花叶型先在新叶出现系统褪绿点，后发展为花叶、畸
9、形;顶枯型在茎上出现系统褐色或坏死条纹，后顶梢枯死。A.2.3 菜豆豌豆感染BBSV后，症状分为局部斑和1系统斑。局部斑是在接种叶上产生局部坏死斑或先为局部褪绿斑而后病斑中心坏死，系统斑不但在接种叶上有坏死斑，新生叶还出现系统枯斑。A.2.4 小扁豆小扁豆感染BBSV后，症状不明显或很长时间才有症状反应，有些品种出现死株，有些品种接种后25 d才见新叶上出现不明显花叶。因此小扁豆不适合作繁殖寄主或鉴别寄主。A.3 分布地区英国、法国、德国、瑞典、捷克、奥地利、波兰、匈牙利、意大利、叙利亚、黎巴嫩、苏丹、摩洛哥、埃及和突尼斯等欧洲、西亚和北非国家。3 GB/T 28064-2011 附录B(规范
10、性附录)双抗体夹心酶联免瘟眼附测定B.1 试材B. 1. 1 酶联板。B. 1.2 包被抗体z特异性的蚕豆染色病毒抗体。B. 1.3 酶标抗体z碱性磷酸醋酶标记的蚕豆染色病毒抗体。B. 1.4 底物z对硝基苯磷酸二铀CpNPP)。B. 1.5 PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7.的NaCl 8.0 g Na2 H P04 1. 15 g KH2P04 0.2 g KCl 0.2 g Tween-20 0.5 mL 蒸锢水定容至1Lo B. 1.6 样品抽提缓冲液CpH7.4)Na2S03 1. 3 g PVP(MW24 00040 000) 20.0 g NaN3 0.2 g PBST定容至1L
11、 , 4 oC储存。B. 1.7 包被缓冲液CpH9.6)Na2 C03 NaHC03 NaN3 蒸馆水定容至1L , 4 .C储存。B. 1.8 酶标抗体稀释缓冲液CpH7.4)BSAC牛血清白蛋白)或脱脂奶粉PVP CMW24 00040 000) NaN3 PBST定容至1L , 4 .C储存。B.1.9 底物CpNPP)缓冲液CpH9.8)岛19C12NaN3 1. 59 g 2.93 g 0.2 g 2.0 g 20.0 g 0.2 g 0.1 g 0.2 g 二乙醇胶97 mL 溶于800mL蒸馆水中，用HCl调pH值至9.8，蒸馆水定容至1Lo 4 .C储存。B.2 程序B.2.
12、1 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100L/孔，37.C孵育2h，清空孔中溶液，PBST洗涤3次。GB/T 28064-2011 B.2.2 样品制备待测样品按1: 10(质量=体积)加人抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，7500 g离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行;空白对照为样品抽提缓冲液。B.2.3 加样根据检测需要设计96孔(或48孔)酶联板，包括2个阴性对照孔、2个阳性对照孔、2个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为100L/孔，每个样品设1个重复。4oc冰箱孵育过夜，酶联板用PBST洗涤3次。B.2.4 加
13、酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100L/孔，37oc 孵育4h，PBST洗涤3次。B. 2. 5 加底物将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用)，按100L/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。B. 2. 6 读数用酶标仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值。注:实际检测时，PBST洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。B.3 结果判断B. 3.1 对照孔的OD4Q5值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即:缓冲液孔和阴性对照孔的OD4Q5值2;同一样品的OD削值应
14、基本一致。B.3.2 在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下:样品OD值/阴性对照OD4Q5值2，判为阳性;样品OD4Q5值/阴性对照OD削值接近阔值，判为可疑样品，需重做一次或用其他方法验证;样品OD405值/阴性对照OD4Q5值2，判为阴性。B.3.3 若满足不了B.3. 1质量要求，则不能进行结果判断。注=质i主控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。5 GB/T 28064-2011 C.1 试剂C. 1. 1 TrizoL裂解液。C. 1.2 三氯甲烧。C. 1.3 异丙醇。C. 1.4 75%乙醇。C. 1.5 去离子水(DEPC处理)。C. 1.6
15、 50XTAE Tris 冰醋酸NazEDTA.2HzO 242 g 52.1 mL 37.2 g 附录C(规范性附录)RT-PCR检测加去离子水定容至1L。用时加水稀释至1XTAE。C. 1.7 6X加样缓冲液0.25%澳酣蓝40%(质量浓度)蔚糖水溶液C.2 实验步骤C.2.1 总RNA提取称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的1.5 mL离心管中，加入1mL的TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀后室温保持5min;4 oC ,12000 g离心10min，取上清液;)10入0.2mL三氯甲皖并剧烈振荡混匀;4 oC , 12 000 g离心10min，取上清液;加0.6倍体
16、积的异丙醇，颠倒混匀，室温保持5min;4 oC ,12000 g离心10min，弃上清液;加75%的乙醇洗涤沉淀，4oC , 7500 g离心2min，弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后，溶于30L去离子水(DEPC处理)中，-20oC保存备用。也可采用等效的试剂盒提取总RNA。C. 2. 2 RT-PCR反应RT-PCR检测引物见表C.l.cDNA的合成:在0.2mL反应管中，加入总RNA6L，lL下游引物(20mol/L)，去离子水4L，10mmol/L dNTPs 1L，65 oC水浴5min，取出后立即放在冰上，加人5 X First Strand Buffer 4L，40 UjL RN
17、ase Block Ribonuclease Inhibitor 1L， O. 1 mol/L DTT 2L， 42 oC水浴2min，然后再加入200U j f1 L Reverse Transcriptase 1L，混匀后420C水浴50min, 70 oC水浴15min，合成cDNAoFirst Strand Buffer和ReverseTranscriptase的用量需要依据反转录酶的品牌进行调整。也可采用一步法RT-PCR试剂盒进行扩增。6 检测基因小外壳蛋白(SCP)GB/T 28064-20门表C.lRT-PCR检测的引物引物序列(5-3)Tgg CAA gTC ACA gTT
18、CgC CgC CTC TTT ggT TTC ACg PCR反应体系见表C.20反应参数:940C5 min;94 oC 308, 54 oC 458, 72 oC 45 8，35个循环;72 oC 7 mino 表C.2PCR反应体系10 X PCR Buffer( MgC12 plus) 2.5 上游引物(20mol/L)o. 5 下游引物(20mol/L)O. 5 Taq酶(5U/L) 0.2 cDNA模板2.0 去离子水补足反应总体积为25LC.2.3 电泳C.2.3.1 制备凝胶配制1.5%(质量=浓度)的琼脂糖凝肢。澳化乙皖可直接加入琼脂糖凝胶中(浓度为o.5g/mL) , 也可
19、在电泳完成后使用漠化乙链染色。C.2.3.2 电泳用1L6X加样缓冲液与5L样品混合，然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝肢置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。C.3 结果判断C. 3.1 阳性对照在499bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。C.3.2 阳性对照、阴性对照和空白对照结果正确，且样品在499bp处元扩增条带，判定结果为阴性。二ON|叮ONH阁。GB/T 28064-2011 附录(资料性附录)生物学测定D 接种病叶加1: l(质量=体积)的磷酸盐缓冲液(0.01mol/
20、L , pH7. 2)于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。0.1 寄主症状0.2 鉴别寄主(diagnosticsp配ies)菜豆:品种Tendergreen和CanadianW onder表现褪绿局部斑和系统褪绿花叶。品种Prince仅为局部侵染，BBSV不能侵染品种Pinto、ldahoRefugee、BlueLake和Tendercrop 0 豌豆:BBSV可侵染所有品种，产生系统褪绿斑驳症状，在冷凉气候下茎和叶片出现坏死。蚕豆:BBSV侵染品种成胡10号后表现花叶型，即接种叶片上有或元局部斑，新叶均呈褪绿条纹状、环状和块状花叶
21、片上出现褪绿斑驳和花叶症状。BBSV不能侵染克色寨(Chenopodiumamaranticolor)，千日红(Gomphrena globosa，普通烟(Nicotiana tabacum)和克利夫兰烟(N.clevelandii)。0.2.1 繁殖寄主(propagationspecies) 0.2.2 豌豆品种Onward，菜豆品种Tendergreen和蚕豆品种成胡10号。试验寄主(assayspecies) 0.2.3 BBSV在菜豆品种Tendergreen上引起局部斑，在蚕豆上表现系统侵染。侵权必究06-A哇-A性-nu FHJV-号一价书足晤版权专有16.00元GB/T 28064-2011 打印H期:2012年4月19HF002A
