VDI 3957 Blatt 16-2015 Biological measuring techniques for the determination and evaluation of effects of air pollution on plants (bioindication) - Determination of genotoxic effec.pdf

1、VEREIN DEUTSCHERINGENIEUREBiologische Messverfahren zur Ermittlung und Beurteilung der Wirkung von Luftverunreinigungen auf Pflanzen (Bioindikation)Nachweis genotoxischer Effekte mit dem Tradescantia-Kleinkern-TestBiological measuring techniques for the determinationand evaluation of effects of air

2、pollution on plants(bioindication)Determination of genotoxic effects with the Tradescantia MCN testVDI 3957Blatt 16 / Part 16Ausg. deutsch/englischIssue German/EnglishVDI/DIN-Handbuch Reinhaltung der Luft, Band 1a: Maximale Immissions-WerteVDI Handbuch BiotechnologieVDI-Handbuch Technik Biomasse/Bod

3、enVDI-RICHTLINIENICS 13.040.20 Oktober 2015 October 2015Vervielfltigung auchfr innerbetrieblicheZwecke nichtgestattet / Reproduction evenfor internal use not permittedDer Entwurf dieser Richtlinie wurde mit Ankndigung im Bundes-anzeiger einem ffentlichen Einspruchsverfahren unterworfen.Die deutsche

4、Version dieser Richtlinie ist verbindlich.The draft of this standard has been subject to public scrutiny after announcement in the Bundesanzeiger (Federal Gazette).The German version of this standard shall be taken as authorita-tive. No guarantee can be given with respect to the English trans-lation

5、FrhereAusgabe: 06.08 Former edition: 06/08Zubeziehen durch /Available at BeuthVerlag GmbH,10772 Berlin AlleRechtevorbehalten /All rights reserved Verein Deutscher Ingenieuree.V.,Dsseldorf 2015Kommission Reinhaltung der Luft im VDI und DIN Normenausschuss KRdLFachbereich UmweltqualittInhalt SeiteVor

6、bemerkung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Anwendungsbereich . . . . . . . . . . . . . . 32 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.1 Prinzip des Verfahrens . . . . . . . . . . . 32.2 Hintergrund des Verfahrens . . . . . . .

7、 . . 42.3 Eignung des Verfahrens . . . . . . . . . . . 43 Durchfhrung des Verfahrens . . . . . . . . . 53.1 Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . 53.2 Anzucht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83.3 Pflanzenschutzmanahmen . . . . . . . . . 93.4 Vorbereitung der Exposition . . . . . . . .

8、93.5 Exposition . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93.6 Fixierung und Lagerung . . . . . . . . . . 113.7 Mikroskopische Auswertung . . . . . . . . 124 Kenngren des Verfahrens . . . . . . . . . . 145 Manahmen zur Qualittssicherung . . . . . 156 Bewertung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15Anha

9、ng A Bezugsquellen . . . . . . . . . . . . . 17Anhang B Formbltter. . . . . . . . . . . . . . . 18Anhang C Auswertebeispiel. . . . . . . . . . . . 20Schrifttum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26Contents PagePreliminary note . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2Introduction . . . . . . . .

10、 . . . . . . . . . . . . 21 Scope . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 Fundamentals . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.1 Principle of the procedure . . . . . . . . . 32.2 Background of the procedure. . . . . . . . 42.3 Suitability of the procedure. . . . . . . . . 43 Procedure. . . . . .

11、 . . . . . . . . . . . . . . 53.1 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53.2 Cultivation . . . . . . . . . . . . . . . . . 83.3 Plant protection measures . . . . . . . . . 93.4 Preparation for exposure . . . . . . . . . . 93.5 Exposure . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93.6 Fixation and st

12、orage . . . . . . . . . . . . 113.7 Microscopic evaluation . . . . . . . . . . . 124 Performance characteristics. . . . . . . . . . 145 Quality assurance measures . . . . . . . . . 156 Evaluation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15Annex A Sources . . . . . . . . . . . . . . . . . 17Annex B For

13、ms . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19Annex C Example of evaluation . . . . . . . . . 21Bibliography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26B974908A824A6748CAAAA99BAB349F63B2C88DD9B0D2BF8368C461B1CCB65CD15BE74F0686BD19CFC1F92DEF1929BEST BeuthStandardsCollection - Stand 2015-11Alle Rechte vorbe

14、halten Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2015 2 VDI 3957 Blatt 16 / Part 16VorbemerkungDer Inhalt dieser Richtlinie ist entstanden unter Be-achtung der Vorgaben und Empfehlungen der Richt-linie VDI 1000.Alle Rechte, insbesondere die des Nachdrucks, der Fotokopie, der elektronischen Verwend

15、ung und der bersetzung, jeweils auszugsweise oder vollstndig, sind vorbehalten.Die Nutzung dieser Richtlinie ist unter Wahrung des Urheberrechts und unter Beachtung der Lizenzbedin-gungen (www.vdi.de/richtlinien), die in den VDI-Merkblttern geregelt sind, mglich.Allen, die ehrenamtlich an der Erarbe

16、itung dieser Richtlinie mitgewirkt haben, sei gedankt.Eine Liste der aktuell verfgbaren Bltter dieser Richtlinienreihe ist im Internet abrufbar unter www.vdi.de/3957.EinleitungUnter dem Begriff Genotoxizitt werden alle Schdi-gungen auf genetischer Ebene bei Organismen zu-sammengefasst. Ein genotoxis

17、cher Schaden kann seine Ursache in einer Mutation oder einer Beein-trchtigung der Genfunktion oder Genexpression, das heit der Genaktivitt, haben. Als genotoxisch wird eine Substanz bezeichnet, die im Vergleich zur Anzahl der spontan auftretenden Mutationen eine si-gnifikant erhhte Mutationsrate ver

18、ursacht. Muta-gene bzw. genotoxische Stoffe haben oft auch eine karzinogene Wirkung. Sie knnen eine Krebs- bzw. Tumorbildung auslsen oder begnstigen.Luftverunreinigungen knnen Stoffe enthalten, die ein genotoxisches Potenzial besitzen, z. B. Dioxine und verschiedene polyzyklische Aromaten. Der Grad

19、der Schdigung wird mageblich von den Stoffeigen-schaften, dem Auftreffen am Wirkort und der dort ausgelsten biologischen Reaktion bestimmt.Fr den Wirkungsnachweis genotoxischer Substan-zen werden sensitive Organismen in verschiedenen Testverfahren eingesetzt, um Risikopotenziale zu er-fassen. Zu ein

20、er bewhrten Gruppe von Testverfahren gehren die Kleinkernteste, die sich als Wirkungskri-terium die Bildung von Genfragmenten als Reaktion auf genotoxische Stoffe bei verschiedenen Testorga-nismen zu eigen machen.Diese Genfragmente knnen je nach Testorganismus an verschiedenen Wirkorten, z. B. Wurze

21、lzellen und Pollenzellen, als sogenannte Kleinkerne sichtbar werden.Preliminary noteThe content of this standard has been developed in strict accordance with the requirements and recom-mendations of the standard VDI 1000.All rights are reserved, including those of reprinting, reproduction (photocopy

22、ing, micro copying), storage in data processing systems and translation, either of the full text or of extracts.The use of this standard without infringement of copy-right is permitted subject to the licensing conditions (www.vdi.de/richtlinien) specified in the VDI Notices. We wish to express our g

23、ratitude to all honorary con-tributors to this standard.A catalogue of all available parts of this series of standards can be accessed on the Internet at www.vdi.de/3957.IntroductionThe term genotoxicity refers collectively to all kinds of genetic damage to organisms. Genotoxic damage can arise from

24、 mutation or from impairment of gene function or gene expression, i. e. of gene activity. A substance that causes a significant increase in the rate of mutation relative to the number of mutations oc-curring spontaneously is designated as genotoxic. Mutagenic or genotoxic substances often also exert

25、 a carcinogenic action. They can trigger or promote can-cer or tumour formation. Air pollutants may contain substances possessing ge-notoxic potential, e. g. dioxins and various polycyclic aromatic compounds. The extent of damage will de-pend largely upon the properties of the substances, whether th

26、ey reach the site of action, and the biolog-ical reaction induced at that site.Sensitive organisms are used in various test proce-dures for detecting the effect of genotoxic substances in order to assess potential risks. As a proven group of test procedures, the micronucleus tests utilise the for-ma

27、tion of gene fragments in various test organisms in response to genotoxic substances as a criterion of ef-fect. Depending upon the test organism, these gene frag-ments may become visible as so-called micronuclei at various sites of action, e. g. root cells and pollen cells.B974908A824A6748CAAAA99BAB

28、349F63B2C88DD9B0D2BF8368C461B1CCB65CD15BE74F0686BD19CFC1F92DEF1929BEST BeuthStandardsCollection - Stand 2015-11All rights reserved Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2015 VDI 3957 Blatt 16 / Part 16 3 1 AnwendungsbereichMit dem Tradescantia-Kleinkern-Test (Tradescantia-MCN-Test) knnen immis

29、sionsbedingte genotoxi-sche Wirkungen in Form erhhter Kleinkernraten in den Pollenzellen der Dreimasterblume (Tradescantiasp.) erfasst und somit eine Aussage ber das genoto-xische Gefhrdungspotenzial luftgetragener Schad-stoffe auf die belebte Umwelt getroffen werden. Tra-descantia wird hierbei als

30、Reaktionsindikator einge-setzt, der nach einer definierten Expositionszeit einen direkten Wirkungsnachweis ermglicht 1.2 Grundlagen2.1 Prinzip des VerfahrensDas Prinzip des Tradescantia-Kleinkern-Tests beruht auf der Erfassung von Keimzellenmutationen in den Pollen. In der frhen Prophase der Meiose

31、reagieren die Pollenmutterzellen von Tradescantia sp. (siehe Abschnitt 3.1.1) sehr empfindlich auf genotoxische Einflsse 2 bis 4. Als Folge einer Schdigung kn-nen Chromosomenbrche und das Herauslsen gan-zer DNA-Fragmente aus dem Kern auftreten, die sich in den Zellen spterer Entwicklungsstadien als

32、Klein-kerne manifestieren (Bild 1). Diese auerhalb des 1 ScopeThe Tradescantia micronucleus test (Tradescantia MCN test) allows determination of genotoxic effects of airborne pollutants in the form of elevated micro-nucleus formation rates in the pollen cells of spider-wort (Tradescantia sp.) and th

33、us permits assessment of the genotoxic hazard potential of such pollutants for the living environment. Tradescantia is used as a response indicator here, which provides direct proof of a biological effect after a given exposure time 1. 2 Fundamentals2.1 Principle of the procedureThe Tradescantia mic

34、ronucleus test is based on the determination of pollen germ cell mutations. In the early prophase of meiosis, the pollen mother cells of Tradescantia sp. (see Section 3.1.1) are extremely sensitive to genotoxic effects 2 to 4. Such damage can lead to chromosome breakage or loss of entire DNA fragmen

35、ts from the nucleus, which manifest themselves as micronuclei in the cells of later devel-opmental stages (Figure 1). These accumulations of DNA outside of the cell nucleus in the cytoplasm can Bild 1. Entwicklung einer Pollenzelle (Meiose) von Tradescantiasp. vom Einzellstadium zum Vierzellstadium

36、Tetrade) unter Bil-dung eines KleinkernsFigure 1. Development of a pollen cell (meiosis) of Tradescantiasp. from the single-cell to the tetrad stage with formation of a micronucleusB974908A824A6748CAAAA99BAB349F63B2C88DD9B0D2BF8368C461B1CCB65CD15BE74F0686BD19CFC1F92DEF1929BEST BeuthStandardsCollect

37、ion - Stand 2015-11Alle Rechte vorbehalten Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2015 4 VDI 3957 Blatt 16 / Part 16Zellkerns im Zytoplasma liegenden DNA-Ansamm-lungen knnen mit dem Mikroskop erfasst und ge-zhlt werden. Die Hufigkeit derartiger Chromoso-menaberrationen in Form von Kleinkernen s

38、tellt das Wirkungskriterium dar. Sie wird sowohl in den Kon-trollpflanzen untersucht, um die natrlich vorkom-mende Spontanmutationsrate zu bestimmen, als auch in den Pflanzen an den einzelnen Messpunkten. Ein statistischer Vergleich der ermittelten Kleinkernra-ten, das heit der Anzahl aufgetretener

39、Kleinkerne pro definierter Anzahl an Pollenzellen, gibt Auf-schluss ber die Hhe der genotoxischen Wirkung an den untersuchten Standorten. Zur besseren statisti-schen Absicherung der Ergebnisse mssen mehrere zeitlich aufeinander folgende Expositionen an einem Messpunkt durchgefhrt werden.2.2 Hintergr

40、und des VerfahrensDer Tradescantia-Kleinkern-Test wurde von Prof. T.-H. Ma an der Western Illinois University, Ma-comb, in den USA Mitte der 1970er-Jahre zur Erfas-sung der Wirkung luftgetragener Schadstoffe und der Wirkung radioaktiver Strahlung entwickelt und sp-ter auch fr die Untersuchung wssrig

41、er Medien ein-gesetzt 1. Anfang der 1990er-Jahre wurden diese Arbeiten durch erste Versuche mit Tradescantia in Europa ergnzt 5 bis 8. Das Testverfahren wird heute von Industrie, Behrden und Forschungsein-richtungen zur Untersuchung von Umweltproben aus Wasser, Boden und Luft, fr Chemikalien sowie f

42、r verschiedene Strahlungsarten eingesetzt. Dabei wer-den sowohl Labor- als auch Freilandexpositionen durchgefhrt. Untersuchungen von Luftbelastungen mit dem Tradescantia-Kleinkern-Test finden sich in der Literatur u. a. bei 9 bis 18. bersichtsartikel zum Einsatz des Verfahrens in verschiedenen Um-we

43、ltmedien wurden von 19 bis 21 verffentlicht.Grundlage fr die im Folgenden beschriebene Vorge-hensweise ist das Testprotokoll der Ringstudie des International Programme on Chemical Safety (IPCS) von 1994 1.2.3 Eignung des VerfahrensTradescantia besitzt als pflanzlicher Bioindikator viele Vorteile. So

44、 ermglicht sie aufgrund ihrer aus-schlielich vegetativ-klonalen Reproduktion den Einsatz gleich bleibenden homogenen Testmaterials. Neben ihrer hohen Empfindlichkeit gegenber geno-toxischen Einflssen in der frhen Prophase der mei-otischen Pollenmutterzellenentwicklung besitzt sie sechs ausreichend g

45、roe Chromosomenpaare, die un-ter dem Mikroskop bei geringer Vergrerung gut an-frbbar und sichtbar sind, sodass die Auswertung der Kleinkerne keine Spezialapparaturen erfordert.be readily observed and counted under a microscope. The frequency of such chromosome aberrations in the form of micronuclei

46、represents the criterion for the biological effect. It is investigated both in control plants in order to determine the rate of naturally oc-curring spontaneous mutation and also in plants lo-cated at individual exposure locations. Statistical comparison of the micronucleus formation rates found, i.

47、 e. the number of micronuclei formed per given number of pollen cells, provides information about the extent of genotoxic effect at the locations investigated. Several sequential exposures have to be performed at a given exposure location to assure sta-tistical reliability of the results. 2.2 Backgr

48、ound of the procedureThe Tradescantia micronucleus test was developed by Prof. T.-H. Ma at Western Illinois University, Ma-comb, in the USA during the mid-1970s in order to assess the effect of airborne pollutants and the effect of ionising radiation, and subsequently also for stud-ying aqueous medi

49、a 1. In the early 1990s, these studies were supplemented by the first experiments with Tradescantia in Europe 5 to 8. The test proce-dure is nowadays applied by industry, government agencies, and research establishments to study envi-ronmental water, soil, and air samples for the effects of chemicals as well as ionising radiation. Both labo-ratory and field exposure are performed. Studies of air pollution by the Tradescantia micronucleus test have