VDI 4253 Blatt 4-2013 Bioaerosols and biological agents - Determination of total cell count by fluorescence analysis after staining with DAPI.pdf

1、 ICS 07.100.99, 13.040.20 VDI-RICHTLINIEN Februar 2013 February 2013 VEREIN DEUTSCHER INGENIEURE Bioaerosole und biologische Agenzien Bestimmung der Gesamtzellzahl mittels Fluoreszenzanalyse nach Anfrbung mit DAPI Bioaerosols and biological agents Determination of total cell count by fluorescence an

2、alysis after staining with DAPI VDI 4253 Blatt 4 / Part 4 Ausg. deutsch/englisch Issue German/English Der Entwurf dieser Richtlinie wurde mit Ankndigung im Bundes-anzeiger einem ffentlichen Einspruchsverfahren unterworfen. Die deutsche Version dieser Richtlinie ist verbindlich. The draft of this gui

3、deline has been subject to public scrutiny after announcement in the Bundesanzeiger (Federal Gazette). The German version of this guideline shall be taken as authori-tative. No guarantee can be given with respect to the English translation. Kommission Reinhaltung der Luft im VDI und DIN Normenaussch

4、uss KRdL Fachbereich Umweltmesstechnik VDI/DIN-Handbuch Reinhaltung der Luft, Band 1a: Maximale Immissions-Werte VDI/DIN-Handbuch Reinhaltung der Luft, Band 4: Analysen- und Messverfahren I VDI-Handbuch Biotechnologie Vervielfltigungauchfrinnerbetriebliche Zwecke nicht gestattet /Reproductionevenfor

5、internalusenot permittedFrhere Ausgabe:04.11 Entwurf,deutschFormeredition:04/11Draft,in German onlyZu beziehen durch /Available atBeuth Verlag GmbH,10772 BerlinAlle Rechte vorbehalten /Allrightsreserved Verein DeutscherIngenieuree.V.,Dsseldorf2013Inhalt Seite Contents Page Vorbemerkung . 2 Einleitun

6、g . 2 1 Anwendungsbereich . 3 2 Begriffe 4 3 Grundlage des Verfahrens . 6 4 Grenzen und Schwierigkeiten des Verfahrens . 7 5 Gerte, Verbrauchsmaterial, Chemikalien und Lsungen . 8 5.1 Reinigung . 8 5.2 Gerte, Verbrauchsmaterial . 8 5.3 Chemikalien und Lsungen . 9 6 Vorbereitung des Sammelguts 9 6.1

7、Impingerproben 9 6.2 Filterproben 10 6.3 Frbung der fixierten Probe . 11 6.4 Hinweise zu Transport und Lagerung 12 7 Quantitativer Nachweis 12 7.1 Grundlegende Hinweise zur Vorgehensweise . 12 7.2 Durchfhrung der Auszhlung . 13 7.3 Analytischer Blindwert 14 8 Berechnung und Angabe der Ergebnisse . 1

8、4 9 Verfahrenskenngren . 17 9.1 Probenaustausch . 17 9.2 Standardabweichung 17 9.3 Probenhomogenitt und Zhlunsicherheiten . 20 9.4 Bestimmungsgrenzen . 20 Anhang A Ermittlung des Mikroskopfaktors 21 Anhang B Zhlprotokoll und Ergebnis-protokoll 23 Schrifttum 27 Preliminary note . 2 Introduction 2 1 S

9、cope . 3 2 Terms and definitions 4 3 Method basics . 6 4 Limits and difficulties of the method 7 5 Apparatus, consumables, chemicals and solutions 8 5.1 Clean-up. 8 5.2 Apparatus, consumables 8 5.3 Chemicals and solutions 9 6 Sample preparation 9 6.1 Impinger samples . 9 6.2 Filter samples . 10 6.3

10、Dyeing of the fixed sample 11 6.4 Directions regarding transport and storage 12 7 Quantitative detection 12 7.1 Basic information to the procedure 12 7.2 Enumeration implementation . 13 7.3 Analytical blank . 14 8 Calculation and presentation of the results 14 9 Process parameters . 17 9.1 Sample re

11、placements . 17 9.2 Standard deviation . 17 9.3 Sample homogeneity and counting uncertainties . 20 9.4 Limits of quantification . 20 Annex A Establishment of the microscope factor . 21 Annex B Count record and summary minutes 25 Bibliography 27 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCDB7EF8AD9NormCD -

12、Stand 2013-04 2 VDI 4253 Blatt 4 / Part 4 Alle Rechte vorbehalten Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2013 Vorbemerkung Der Inhalt dieser Richtlinie ist entstanden unter Beachtung der Vorgaben und Empfehlungen der Richtlinie VDI 1000. Alle Rechte, insbesondere die des Nachdrucks, der Fotokop

13、ie, der elektronischen Verwendung und der bersetzung, jeweils auszugsweise oder vollstn-dig, sind vorbehalten. Die Nutzung dieser VDI-Richtlinie ist unter Wah-rung des Urheberrechts und unter Beachtung der Lizenzbedingungen (www.vdi-richtlinien.de), die in den VDI-Merkblttern geregelt sind, mglich.

14、Allen, die ehrenamtlich an der Erarbeitung dieser VDI-Richtlinie mitgewirkt haben, sei gedankt. Eine Liste der aktuell verfgbaren Bltter dieser Richtlinienreihe ist im Internet abrufbar unter www.vdi.de/4253. Preliminary note The content of this guideline has been developed in strict accordance with

15、 the requirements and rec-ommendations of the guideline VDI 1000. All rights are reserved, including those of reprint-ing, reproduction (photocopying, micro copying), storage in data processing systems and translation, either of the full text or of extracts. The use of this guideline without infring

16、ement of copyright is permitted subject to the licensing con-ditions specified in the VDI Notices (www.vdi-richtlinien.de). We wish to express our gratitude to all honorary contributors to this guideline. A catalogue of all available parts of this series of guidelines can be accessed on the internet

17、 at www.vdi.de/4253. Einleitung Die Ermittlung und Bewertung der Emissionen und Immissionen von Partikeln und gasfrmigen Stof-fen sind im Bundes-Immissionsschutzgesetz (BImSchG) und seinen Verordnungen sowie in der TA Luft geregelt. Ziel dieser Regelungen ist es, Menschen, Tiere und Pflanzen, den Bo

18、den, das Wasser, die Atmosphre sowie Kultur- und sonsti-ge Sachgter vor schdlichen Umwelteinwirkun-gen zu schtzen und dem Entstehen schdlicher Umwelteinwirkungen vorzubeugen. Die gesetzlichen Vorgaben zur Begrenzung mikro-bieller Emissionen sind bislang nur allgemein for-muliert. So schreibt die TA

19、Luft fr bestimmte Anlagen vor: Die Mglichkeiten, die Emissionen an Keimen und Endotoxinen durch dem Stand der Technik entsprechende Manahmen zu vermin-dern, sind zu prfen“. Ergnzend wurden zahlreiche technische Regeln im Arbeitsschutz (Technische Regeln fr Biologische Arbeitsstoffe TRBA) und Umwelts

20、chutz erstellt. Weiterfhrende Informationen finden sich in der Schriftenreihe der Kommission Reinhaltung der Luft (KRdL) Band 30 1, Band 35 2, Band 39 3 und Band 44 4. Der Themenbereich Bioaerosole und biologische Agenzien“ ist aufgrund seiner Komplexitt in meh-rere Richtlinienreihen unterteilt. Die

21、 Richtlinienreihe VDI 4250 beschreibt die Wir-kung mikrobieller Luftverunreinigungen auf den Menschen. Introduction The measurement and assessment of particles and gaseous chemical compounds in emissions and ambient air is regulated by the German Federal Immission Control Act (BImSchG) and the assoc

22、i-ated implementing ordinances including the Tech-nical Instructions on Air Quality Control (TA Luft). The purpose of these regulations is to protect humans, animals and plants, soil, water, the atmosphere as well as cultural objects and other material goods from harmful effects on the envi-ronment

23、and to prevent the occurrence of any such harmful effects on the environment. The statutory requirements for the limitation of microbial emissions have so far not been detailed and are of a general nature only. TA Luft specifies for certain facilities, that “The possibilities to re-duce emissions of

24、 germs and endotoxins by state of the art techniques shall be examined.” Additionally numerous technical rules have been established in the field of occupational health and safety (Technical Rules for Biological Agents TRBA) and environmental protection. Further information can be obtained from the

25、publication series by the Commission on Air Pollution Preven-tion (Kommission Reinhaltung der Luft KRdL) Volume 30 1, Volume 35 2, Volume 39 3 and Volume 44 4. The subject area ”Bioaerosols and biological agents“ is divided into several guideline series due to its complexity. The series of guideline

26、s VDI 4250 describes the impact of microbial air pollution on humans. B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCDB7EF8AD9NormCD - Stand 2013-04All rights reserved Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2013 VDI 4253 Blatt 4 / Part 4 3 Die Richtlinienreihe VDI 4251 legt die Bedingun-gen fest, die bei

27、 der Planung von Immissionsmes-sungen mikrobieller Luftverunreinigungen und bei der Ausbreitungsmodellierung bercksichtigt wer-den mssen. In der Richtlinienreihe VDI 4252 werden die ver-schiedenen Verfahren zur Probenahme von Bioae-rosolen beschrieben und die Anforderungen an die Durchfhrung der Imm

28、issionsmessungen festge-legt. Die Richtlinienreihe VDI 4253 legt die Bedingun-gen fr die Anzucht und Detektion von Mikroor-ganismen sowie fr die Analyse von Viren fest und baut auf der in VDI 4252 und VDI 4257 beschrie-benen Probenahme auf. Die Richtlinienreihe VDI 4254 wird sich mit der Analyse von

29、 gasfrmigen Luftverunreinigungen mikrobieller Herkunft wie MVOC, Endotoxinen, Mykotoxinen und Glucanen beschftigen. Die Richtlinienreihe VDI 4255 stellt die unter-schiedlichen Quellen mikrobieller Luftverunreini-gungen dar und beschreibt Verfahren zur Minde-rung dieser Emissionen. In der Richtlinien

30、reihe VDI 4256 werden die sta-tistischen Kenngren, die fr die Beschreibung und Vergleichbarkeit der Verfahren notwendig sind, festgelegt. Die Richtlinienreihe VDI 4257 beschreibt die Pla-nung, die Durchfhrung und die verschiedenen Verfahren der Emissionsmessung von mikrobiellen Luftverunreinigungen.

31、 Die Richtlinienreihe VDI 4258 wird die Herstel-lung von Prfbioaerosolen zur Validierung von Messverfahren beschreiben. Die Anwendung der Richtlinie setzt die Berck-sichtigung der oben aufgefhrten Richtlinienreihen voraus. Eine bersicht der aktuellen Richtlinien ist im Internet unter www.vdi.de/bioa

32、erosole abruf-bar. The series of guidelines VDI 4251 defines the con-ditions to be taken into account in ambient air measurement planning and dispersion modelling for microbial air pollutants. In series of guidelines VDI 4252 different bioaero-sol sampling methods are described and the re-quirements

33、 for the realization of the ambient air measurement are laid down. The series of guidelines VDI 4253 lays down the conditions for cultivation and detection of bioaero-sols as well as for the analysis of viruses and is based on the sampling method described in VDI 4252 and VDI 4257. The series of gui

34、delines VDI 4254 will be con-cerned with the analysis of gaseous air pollution of microbial origin such as MVOC (microbial volatile organic compounds), endotoxins, mycotoxins and glucanes. The series of guidelines VDI 4255 presents differ-ent sources of emission of microbial air pollution and descri

35、bes methods for the reduction of these emissions. The series of guidelines VDI 4256 defines the sta-tistical characteristics required for the description and comparability of the methods. The series of guidelines VDI 4257 describes the planning, the procedure and the different methods for emission m

36、easurements of microbial air pollut-ants. The series of guidelines VDI 4258 will describe the preparation of testing bioaerosols for the vali-dation of measurement methods. The application of this guideline presupposes the consideration of the above guideline series. An overview of all relevant guid

37、elines can be accessed on the internet at www.vdi.de/bioaerosols. 1 Anwendungsbereich Die vorliegende Richtlinie beschreibt ein Auswer-teverfahren zur Quantifizierung von Mikroorga-nismen durch mikroskopische Zhlung von Parti-keln nach einer Frbung DNA-haltiger Strukturen (DNA, Desoxyribonukleinsure

38、). Es handelt sich um ein kultivierungsunabhngiges Verfahren, das es ermglicht, Proben auszuwerten, die z. B. nach 1 Scope The present guideline describes an evaluation method for quantification of microorganisms by microscopic particle count after staining of DNA containing structures (DNA: deoxyri

39、bonucleic acid). It is a matter of a cultivation-free method that enables evaluation of samples that have been collected, for example, after the guidelines B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCDB7EF8AD9NormCD - Stand 2013-04 4 VDI 4253 Blatt 4 / Part 4 Alle Rechte vorbehalten Verein Deutscher Ingeni

40、eure e.V., Dsseldorf 2013 VDI 4252 Blatt 21), VDI 4252 Blatt 3 fr Auen-luftmessungen oder VDI 4257 fr Emissionsmes-sungen gesammelt wurden. Durch die kultivie-rungsunabhngige Analyse werden lebende und tote Mikroorganismen erfasst. Der Einsatz dieses Nachweisverfahrens bietet sich insbesondere dann

41、an, wenn Mikroorganismen auf dem Weg von der Emissionsquelle zum Probenahmeort in besonde-rem Mae lebensfeindlichen Umwelteinflssen, z. B. Einwirkung von Hitze, Strahlung, Trocken-heit oder mechanischem Stress, ausgesetzt sind, sodass die Mikroorganismen nicht mehr kultiviert werden knnen oder zumin

42、dest von einer deutlich verminderten Kultivierbarkeit auszugehen ist. Eine Differenzierung von Mikroorganismen ist mit die-ser Methode nicht mglich. Die Anwendung dieses Verfahrens setzt voraus, dass Anwender grundstz-lich in der Lage sind, luftgetragene biogene Parti-keln wie Bakterien, Sporen, Hyp

43、hen, Pollen oder Pflanzenhaare (Trichome) anhand von morpholo-gischen Kriterien unterscheiden zu knnen. Diese Richtlinie ist fr einen Konzentrationsbereich ab einer Grenordnung von GZZ = 105Zellen/m3(GZZ Gesamtzellenzahl) fr die Probenahme mit Impingern bei einem Luftprobenahmevolumen von 0,5 m3ausg

44、elegt. Bei geringeren zu erwartenden GZZ sind grere Luftprobenahmevolumina erfor-derlich, die mithilfe von Filtrationsverfahren mit Polycarbonatfiltern1)erreicht werden knnen (siehe Tabelle 2, Abschnitt 9.4). VDI 4252 Part 21)and VDI 4252 Part 3 for ambi-ent air measurements or VDI 4257 for emission

45、 measurements. Both living and dead microorgan-isms are measured by the cultivation-free method. Application of this verification procedure is rec-ommended especially in cases where microorgan-isms are exposed on their way from the emission source to the sampling location to a special degree to envi

46、ronmental impacts that are hostile to life, e.g. the impacts of heat, radiation, drought or me-chanical stress, with the result that microorganisms can no longer be cultivated or a distinctly reduced cultivability must at least be assumed. A differen-tiation of the microorganisms is not possible wit

47、h this method. The application of this method re-quires that the operators are principally capable of distinguishing between air borne biogenic particles such as bacteria, spores, hyphae, pollens or trichomes on the basis of morphological criteria. This guideline is designed for a concentration rang

48、e starting from an order of magnitude of GZZ = 105 cells/m3(GZZ total cell count) for sampling with impingers at an air sampling volume of 0,5 m3. Larger air sampling volumes are re-quired in case of anticipated lower total cell count. That can be achieved by means of filtration meth-ods with polyca

49、rbonate filters1)(see Table 2, Sec-tion 9.4). 2 Begriffe Fr die Anwendung dieser Richtlinie gelten die folgenden Begriffe: Aggregat Zusammenballung schwer unterscheidbarer, gege-benenfalls partikelassoziierter Zellen. Antifading-Reagenz Flssigkeit, die eingesetzt wird, um die Fluores-zenzintensitt des DNA-Farbstoffkomplexes wh-rend des Mikroskopierens aufrechtzuerhalten. 2 Terms and definitions For the purposes of this guideline, the following terms and definit