DB33 T 536-2005 动物尿样中莱克多巴胺的测定.doc

1、 ICS 65.120 B 46 备案号： 浙 江 省 地 方 标 准 DB33 DB33/T 536 2005 动物尿样中莱克多巴胺的测定 Determination of ractopamine in animal urine 2005-02-17 发布 2005-03-18 实施 浙江 省质量技术监督局 发布 DB33/T 536 2005 I 前 言 本标准由浙江省农业厅提出并归口。 本标准由浙江省畜产品质量安全检测中心、浙江省疾病预防控制中心负责起草，浙江一星集团饲料有限责任公司参与起草。 本标准主要起草人：应永飞、吴平谷、陆春波、林仙军、周文海、任玉琴、屈健、浦琴华。 DB33/T

2、 536 2005 1 动物尿样中莱克多巴胺的测定 1 范围 本标准规定了以酶联免疫（ ELISA）法、高效液相色谱（ HPLC）法和气相色谱质谱（ GC MS）法检测动物尿样中莱克多巴胺的方法，规定 GC MS法为仲裁法。 本标准适用于动物尿样中莱克多巴胺的测定。 酶联免疫（ ELISA）法为筛选方法，检测限为 5 g/L，高效液相色谱（ HPLC）法和气相色谱质谱（ GC MS）法为定量方法，定量限 HPLC法为 5 g/L、 GC MS法为 1 g/L。 线性范围：酶联免疫（ ELISA）法为 0.005ng-0.05ng，高效液相色谱（ HPLC）法为 2.5ng-10ng，气相色谱质

3、谱（ GC MS）法为0.05ng-1.0ng。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根 据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 试样制备 采集的尿样应保存于 4左右的冰箱中。尿样如有混浊，应经离心处理。 第一法 酶联免疫法 4 原理与方法 4.1 原理 本方法是酶联免疫法中的竞争性测定法，其主要原理是：吸附在孔内的莱克多巴胺与标准或样品中的莱克

4、多巴胺竞争性地与莱克多巴胺抗体相结合，与标准品或样品相结合的莱克多巴胺抗体被洗涤去除后，只剩下与微孔内药物相结合的抗体，其再与加入的酶标记的第 二抗体相结合，酶底物在酶作用下产生蓝色产物，吸光度的高低与样品中莱克多巴胺的含量成反比。 4.2 方法 采用 莱克多巴胺酶联免疫试剂盒或类似产品，按试剂盒说明书操作。 5 试剂和溶液 5.1 除非 另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合 GB/T 6682 二级水的规定。 5.2 PBS 缓冲液：用水 10 倍稀释厂商提供的浓缩 PBS 缓冲液。 5.3 工作洗液：用水 20 倍稀释厂商提供的浓缩洗液。 5.4 第二抗体工作液：用第二抗体

5、稀释液 2500 倍稀释第二抗体。 6 仪器与设备 6.1 微孔板酶标仪 (带 450nm 滤光片 )。 DB33/T 536 2005 2 6.2 振荡器。 6.3 冷冻离心机。 6.4 微量加样器及配套 吸头： 20 L, 50 L, 100 L, 200 L 。 6.5 冰箱。 6.6 洗板机。 6.7 生化培养箱。 6.8 分析天平：感量 0.01g。 7 测定步骤 7.1 注意事项 不同品牌的试剂盒其操作步骤可能略有差别，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。 7.2 样品 处理 把试样于 4000rpm的转速离心 10min，取上清液用 PBS缓冲液（ 5.1）稀释十倍后直接

6、加入微孔进行ELISA测定。 7.3 测试程序 7.3.1.1 根据所测定样品及标准数，计算出所需微孔条数，将微孔条插入微孔架，标准和样品做两个孔的平行重复，记录标准和样品的位置。 7.3.1.2 加入 50 L 的标准品和处理好 的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行重复。 7.3.1.3 加入 100 L 第一抗体溶液到每一个微孔中，在 37孵育 30 分钟后倒出孔中的液体，将微孔架倒置在洗水纸上拍打（每轮拍打 3 次）以保证完全除去孔中的液体，再加入工作洗液（ 5.2） 250 L，重复操作两遍。最后用吸水纸吸干。 7.3.1.4 加入 150 L 稀释的酶标记的第二抗体（ 5.3）

7、 37孵育 30 分钟后倒出孔中的液体，将微孔架倒置在洗水纸上拍打（每轮拍打 3 次）以保证完全除去孔中的液体，再加入工作洗液（ 5.2） 250 L，重复操作两遍。最后用吸水纸吸干。 7.3.1.5 加入 100 L 酶底物液到 微孔中，充分混合并在室温孵育 5-10min。 7.3.1.6 加入 50 L 反应终止液到微孔中，混合后在 450nm 处测量吸光度值。 8 结果计算 以 空白（浓度为 0的标准溶液） 吸光度值为 100%计算，折算出各标准和样品的相对吸光度值。 标准的吸光度值 (或样品 ) 相对吸光度值（ %） = 100 空白的吸光度值 计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应

8、浓度 (ng/L)的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在200-2000ng/L范围内应当成为线性。相对应每一个样品 的浓度 (ng/L)可以从校正曲线上读出。 第二法 高效液相色谱法 9 方法 原理 用叔丁基甲醚为提取剂提取动物尿样中的莱克多巴胺，经固相萃取柱净化，浓缩后用 2乙酸溶液定容，用高效液相色谱荧光检测法分离测定。 10 试剂和溶液 DB33/T 536 2005 3 10.1 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合 GB/T 6682 二级水的规定。 10.2 乙腈：色谱纯。 10.3 甲醇。 10.4 冰醋酸。 10.5 乙酸 乙酯。 10.6 叔丁基甲醚。 10

9、.7 无水硫酸钠。 10.8 戊烷磺酸钠：色谱级。 10.9 氢氧化钠 。 10.10 氯化钠。 10.11 1mol/L NaOH 溶液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液 56mL，加水至 1000mL， 摇匀。 10.12 2乙酸溶液： 5mL 冰醋酸加水至 250mL，混匀。 10.13 3甲醇 /乙酸乙酯溶液：取 15mL 甲醇加乙酸乙酯至 500mL，混匀。 10.14 50甲醇 /乙酸乙酯溶液：取 250mL 甲醇加乙酸乙酯至 500mL，混匀。 10.15 戊烷磺酸钠溶液：取 800mL 水，加 20mL 冰醋酸和 0.87g 戊烷磺酸钠（ 10.7， C5H11O3SNaH2O），混匀

10、。 10.16 固相萃取柱 1：每根柱填料量为 500mg，柱体积 5mL。 10.17 莱克多巴胺标准溶液 ： 莱克多巴胺贮备液（ 250 g/mL） ： 精密称取莱克多巴胺对照品 25mg，置 100ml容量瓶中，用甲醇（ 10.2）溶解并定容至刻度，其浓度为 250 g/ml，置 -20冰箱中，可保存 3个月。 莱克多巴胺稀释液（ 5 g/ml） ： 精密量取 1ml莱克多巴胺贮备液（ 10.16.1），置 50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，为莱克多巴胺工作液。 莱克多巴胺工作溶液 ： 分别准确吸取一定量的标准稀释液（ 10.16.2），用 2乙酸溶液（ 10.11）稀释、定

11、容，配制成浓度为 0.05 g/mL、 0.1 g/mL、 0.2 g/mL、 0.5 g/mL、 1.0 g/mL、 2.0 g/mL的标准溶液。 11 仪器 设备 11.1 高效液相色谱仪（配荧光检测器）。 11.2 冷冻离心机。 11.3 振荡器 。 11.4 分液漏斗 100mL。 11.5 微孔滤膜 0.45 m。 11.6 涡旋混合器。 11.7 分析天平 精度 0.0001g。 11.8 旋转蒸发仪。 11.9 鸡心瓶 50mL。 11.10 离心管 50mL， 10mL。 11.11 氮吹仪。 12 测定步骤 12.1 试样提取 1固相萃取柱的填充料为硅藻土和硅胶。 DB33/

12、T 536 2005 4 取试样 10.0mL至 50mL离心管中，用 1mol/LNaOH溶液调节 pH值为 10，加 1g氯化钠 （ 10.9） ，振摇数秒，加 10mL叔丁基甲醚 （ 10.5） 提取，涡旋 1min，中速振荡 10min， 7000rpm离心 5min，取上清液经无水硫酸钠 （ 10.6） 过 滤，收集于 50mL鸡心瓶中；另取 10mL叔丁基甲醚重复提取一次。用 2mL叔丁基甲醚洗涤无水硫酸钠，旋转蒸干。 12.2 试样 净化 用 2mL乙酸乙酯 （ 10.4） 溶解鸡心瓶中的残余物，过固相萃取柱（ 10.15，先经 5mL甲醇和 5mL乙酸乙酯润洗）；另取 3mL

13、3甲醇 /乙酸乙酯 （ 10.12） 洗涤鸡心瓶的残余物一次，过柱；再用 5mL 50甲醇 /乙酸乙酯 （ 10.13） 洗脱，氮吹至干。 12.3 定容 用 2乙酸溶液（ 10.11）定容到 1mL，过膜，上机。 12.4 测定 12.4.1 高效液相色谱条件 色谱柱： C18柱，长 250mm，内径 4.6mm，粒度 5 m，或相当者。 保护柱： C18柱，长 20mm，内径 3.9mm，粒径 5 m，或相当者。 流动相：戊烷磺酸钠溶液（ 10.15）：乙腈（ 10.1） 80： 20，使用前脱气。 流速： 1.0mL/min。 激发波长： 226nm。 发射波长： 306nm。 进样量：

14、 50 L。 12.4.2 上机测定 取相应浓度的标准工作液和样品制备液，分别注入液相色谱仪，作单点或多点校准，以色谱峰面积按外标法积分定量。 13 结果计算与表达 试样中莱克多巴胺的含量按下式计算： 1000 Ai Cs Vs X As Vi 式中： X 样品中莱克多巴胺的含量 ( g L) Ai 样品峰面积 As 对照溶液峰面积 Cs 对照溶液浓度（ g/ mL） Vi 样品体积（ mL） Vs 定容体积（ mL） 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留 2 位有效数字。 14 精密度 14.1 重复性 实验室内平行测定间的相对偏差不大于 10。 14.2 再现性 实验室间测定的相对 偏

15、差不大于 15。 DB33/T 536 2005 5 第三法 气相色谱 -质谱法 15 方法 原理 用叔丁基甲醚为提取剂提取动物尿样中游离的莱克多巴胺，然后用固相萃取柱净化， BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺） +TMCS（三甲基氯硅烷）衍生，最后用 GC/MS法进行定性定量分析。 16 仪器与试剂 16.1 气 -质联用仪。 16.2 烘箱 。 16.3 BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺） +1%TMCS （三甲基氯硅烷）。 16.4 莱克多巴胺标准贮备溶液（ 5mg/mL）：准确称取 50mg 莱克多巴胺于 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中备用。 16.5 莱

16、克多巴胺标准工作溶液：取莱克 多巴胺标准贮备溶液，用甲醇稀释至所需浓度。 16.6 甲苯 。 16.7 其它仪器，同 11。 16.8 其它 试剂 ，同 10。 17 测定步骤 17.1 试样提取 同 HPLC法 12.1。 17.2 试样净化 同 HPLC法 12.2。 17.3 试样衍生 蒸发剩余物加 0.1 mL BSTFA+1%TMCS（ 16.3） ，加盖瓶于旋涡混合器上震荡，在 80的烘箱中加热 1.0 h，氮气吹干，加 0.2mL甲苯 （ 16.5） 溶解。 取适量的莱克多巴胺标准工作溶液，氮气吹干，与试样同法进行衍生化。 17.4 色谱条件 色谱柱： 5%苯基 甲基聚硅氧烷弹性

17、石英毛细管柱 (30 m 0.25 mm 0.25 m)，或相当者。 进样口温度： 300。 柱温程序：初温 150，保持 3 min，然后以 10 min升至 230，保持 10min，再以 20 min升至 280保持 10min。 载气：高纯氦气（ 99.999%）。 流速： 1.0mL/min，不分流进样。 进样量： 1.0l。 17.5 质谱条件 EI源：源温 230。 电子能量： 70eV。 接口温度： 280。 电子倍增器电压： 1506V。 质量扫描范围： 30 550U。 选择离子监测方式（ SIM）。 监测离子（ m/z）： 267、 250 、 179、 502 。 溶剂延迟： 5 min 。 DB33/T 536 2005 6 17.6 上机测定 莱克多巴胺 对照 溶液和试液分别注入气相色谱质谱联用仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。 18 结果 计算 结果按下式计算： X=m1 n/m 式中： X 样品中莱克多巴胺含量（ ng/g） m1 质谱测定对应莱克多巴胺量（ ng） m 取样量（ g） n 稀释倍数 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留 3 位有效数字。 19 精密度 19.1 重复性 实验室内平行 测定 间的相对偏差不大于 10。 19.2 再现性 实验室间测定的相对偏差不大于 15。