1、1第 39讲 无菌操作技术实践考纲要求 1.微生物的分离和培养(B)。2.某种微生物数量的测定(C)。3.微生物的应用(B)。4.实验：微生物的分离与培养(b)。考点一 微生物的分离和培养1相关技能、技术和方法(1)无菌操作的技能干热灭菌法是指将准备灭菌的物品放在干热灭菌箱内，在 160170下加热 12h 以达到灭菌的目的。湿热灭菌法常采用高压蒸汽灭菌锅进行，其使用包括加水、装锅、加热排气、保温保压、出锅等步骤。(2)培养基的配制培养基的概念：是为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。营养组成：一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无
2、机盐等最基本的物质。此外，根据拟培养的微生物的不同需要，有时还要加入维生素等特殊的营养物质，并要调节培养基的 pH使之满足微生物生长的需要。种类：天然培养基和合成培养基，前者的主要优点是取材便利、营养丰富、配制简便，缺点是营养成分难以控制、实验结果的重复性较差；后者的优点是化学成分及其含量明确，实验的可重复性好，缺点是配制繁琐、成本较高。(3)微生物的接种接种：是指在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。常用的工具有玻璃涂布器、接种针、接种环等，在涂布平板接种时要用玻璃涂布器，穿刺接种时要用接种针，在斜面接种或在固体培养基平板上进行划线接种时要用接种环。2大肠杆菌的接种与分离培养(1)配制牛
3、肉膏蛋白胨培养基其操作步骤：配制培养基调节 pH分装包扎灭菌搁置斜面。(2)斜面接种和培养大肠杆菌主要目的：菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。主要步骤：准备接种接种环灭菌试管口灭菌挑取少许菌种划线接种在 37恒2温箱中培养大肠杆菌 24h将增殖的菌种放置在冰箱的冷藏室中(4)保存。(3)平板划线分离和培养大肠杆菌平板制作的方法及注意事项a请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙乙甲丁。b甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。c丁中的操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。易混辨析 消毒和灭菌项目 条件 结果
4、常用方法 应用范围煮沸消毒法 日常用品巴氏消毒法 不耐高温的液体消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灼烧灭菌法 接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属用具等灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子高压蒸汽灭菌法培养基及容器的灭菌(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质( )(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( )(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害( )(4)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落( )
5、(5)用涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落( )如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析：3(1)获得图 A效果和图 B效果的接种方法分别是什么？提示 获得效果 A的接种方法为涂布平板法，获得效果 B的接种方法为平板划线法。(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？提示 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。(3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？提示 火焰附近存在着无菌
6、区域。命题点一 微生物的培养和无菌技术分析1(2018全国，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具_(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_。(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_。在照射前，适量喷洒_，可强化消毒效果。(4)水厂供应的自来水通常是经过_(填“氯气” “乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可
7、能的原因是_。答案 (1)可以 (2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 (3)破坏 DNA结构 消毒液 (4)氯气(5)未将锅内冷空气排尽解析 (1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内，在 160170条件下加热 12h。耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。(2)巴氏消毒法是在 7075条件下煮 30min或在 80条件下煮 15min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养物质损失较少。(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射 30min，紫外线能破坏微生物的 DNA结构，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前
8、，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并4没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。2高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选出了能高效生产高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如下图所示。请据图回答下列问题：(1)号培养基从物理状态来看，属于固体培养基，配制时要加入_作为凝固剂，从用途来看属于选择培养基，应以_作为唯一碳源。(2)配制固体培养基的基本步骤是( )A计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C计算、称量、溶化、灭菌、倒平
9、板D计算、称量、灭菌、溶化、倒平板(3)溶化时，烧杯中加入琼脂后要不停地_，防止琼脂糊底引起烧杯破裂。对培养基灭菌的方法一般为_。(4)过程是_，过程所使用的接种方法是_法。(5)部分嗜热菌在号培养基上生长时可释放_分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈，挑选相应的菌落，接种到号培养基进一步分离纯化后，再对菌种进行_培养。答案 ( 1)琼 脂 淀 粉 (2)C (3)搅 拌 高 压 蒸 汽 灭 菌 (4)稀 释 涂 布 平 板 (5)淀 粉 酶 扩大解析 (1)固体培养基中通常加入琼脂作为凝固剂。本实验的目的是获得生产高温淀粉酶的嗜热菌，故其选择培养基中应以淀粉作为唯一碳源。(2)配制固体培
10、养基的基本步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。(3)配制培养基加热溶化时，要注意加入琼脂后要不断搅拌，防止琼脂糊底。对培养基的灭菌一般采用高压蒸汽灭菌法。(4)仔细观察题图可知，过程是菌液稀释，过程是采用涂布平板法接种。(5)能产生淀粉酶的部分细菌能分解利用淀粉，其菌落周围会出现透明圈，取这样的菌落再分离纯化可获得相应菌种，以后可以对菌种进行扩大培养用于生产。科学探究 (1)培养基的配制原则目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。5营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。pH 要适宜：细菌为 6.57.5，放线菌为 7.58.5，真菌为 5.06.0，培养不同
11、微生物所需的 pH不同。(2)微生物对主要营养物质的需求特点自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的 CO2，氮源可由含氮无机盐提供。异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。命题点二 微生物的纯化方法及过程分析3(2018全国，37)回答下列与酵母菌有关的问题：(1)分离培养酵母菌通常使用_(填“牛肉膏蛋白胨” “MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用_灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到菌落，菌落的含义是_。(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进_
12、(填“菌体快速增殖” “乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进_(填“菌体快速增殖” “乙醇产生”或“乳酸产生”)。(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是_。答案 (1)麦芽汁琼脂 高压蒸汽 由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体 (2)菌体快速增殖 乙醇产生 (3)酵母菌分解葡萄糖会产生 CO2，CO 2使面包松软解析 (1)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛的细菌培养基；MS 培养基是满足植物细胞的营养和生理需要的培养基；麦芽汁琼脂培养基通常用于酵母菌(真菌)的培养、鉴定及菌种保存。培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法。菌落是指由
13、一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。(2)酵母菌为兼性厌氧型微生物，在有氧条件下进行有氧呼吸为其自身的繁殖提供能量；在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸产生乙醇。(3)面包松软是因为制作过程中加入的酵母菌可以分解葡萄糖产生大量的 CO2，CO 2遇热膨胀，使得制作的面包松软多孔。4牛奶是微生物培养的良好培养基，牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物，为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图 1所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1mL生牛奶稀释液至盛有 9mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复 2次。请回答下列有关问题：6(1)巴氏消毒的方法是_，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好
14、处是_。(2)取最终的牛奶稀释液 0.1mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是图 2中的_。(3)图 1中所示方法为稀释涂布平板法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了 3个培养皿，菌落数分别为 35个、33 个、34 个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为_个，运用这种方法统计的结果往往较实际值_(填“偏大”或“偏小”)，原因是_。(4)消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用该方法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应做什么改动？_。(5)从生牛奶取样培养得到的菌落中混有各种杂菌，从中检测出大肠杆菌的方法是在培养基中加入_，若菌落具有_特征
15、，则可以认定为大肠杆菌。答案 (1)在 7075煮 30min(或在 80煮 15min) 牛奶的营养成分不被破坏 (2)B (3)3.4106 偏小 个别菌落可能是由两个或多个细胞形成的 (4)减少稀释次数 (5)伊红美蓝 (金属光泽的紫)黑色解析 (1)巴氏消毒的方法是在 7075煮 30min或在 80煮 15min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。(2)涂布使用的工具是涂布器，图 2中 B正确。(3)菌落的平均数是 34个，生牛奶中每毫升含细菌数菌落平均数/涂布量稀释倍数34 个/0.1 mL1043.410 6个/mL。在统计菌落时，当两个或多个细胞连在一起时，
16、平板上观察到的只是单个菌落，所以运用这种方法统计的结果往往比实际值偏小。(4)由于消毒后牛奶中绝大部分细菌被杀死，所以可减少稀释次数。(5)大肠杆菌的代谢产物会使伊红美蓝鉴别培养基出现金属光泽的紫黑色。考点二 分离特定的微生物并测定其数量71区分涂布平板法和混合平板法(1)过程如图(2)结果不同涂布平板法：细菌菌落通常仅在平板表面生长。混合平板法：细菌菌落出现在平板表面及内部。(3)目的相同：分离各种目的微生物。2选择培养分离(1)方法：针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。(2)原理：不同微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的
17、敏感性。(3)用途：从众多微生物中分离出特定的微生物。3菌落(1)概念：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。(2)特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。4土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。(2)统计菌落数目一般用涂布平板法。8统计菌落数目时，培养基表面生长的 1个菌落，来源于样品稀释液中
18、1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30300 的平板进行计数。从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(平均菌落数涂布的稀释液体积)稀释倍数。利用涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。(3)实验流程：土壤取样样品的稀释微生物的培养与观察细菌的计数。5分解纤维素的微生物的分离(1)土壤中能分解纤维素的微生物种类很多，有细菌、真菌等，它们能分泌纤维素酶，将纤维素分解成小分子糖类物质以满足自身生命活动的需要，同时也能改善土壤的结构，提高土壤的肥力。(2)纤维素分解菌的筛选原理纤维素分解菌Error! 红色复合物 红色消失，出现透明圈 纤 维 素 酶 筛选方法：刚果红
19、染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。实验流程土壤取样：富含纤维素的环境选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度梯度稀释：制备系列稀释液涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落96显微镜直接计数法(1)原理：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。(2)缺点：不能区分死菌还是活菌。(3)1mL培养液中菌体的总数换算公式为：1625 型的血球计数板：1mL 悬液中待测标本(菌体)数 400104稀释倍数。100小 方 格 内 菌 体 数1002516 型的血球计数板：1mL 悬液中待测标
20、本(菌体)数 40010480小 方 格 内 菌 体 数80稀释倍数。(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类( )(2)对细菌进行计数只能采用涂布平板法，而不能用平板划线法( )(3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源( )(4)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( )(5)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌( )研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明降解圈的菌落如图 1所示，将筛选到的纤维素酶高产菌株 J1和 J4在不同的温度和 pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果如图 2
21、，请分析：(1)透明圈是如何形成的？提示 刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物发生这种反应。细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解，形成透明圈。10(2)图中透明圈大小代表什么？降解纤维素能力最强的菌株是哪种？提示 透明圈大小与纤维素酶的量和活性有关，降解纤维素能力最强的是菌株。(3)结合图 2推测哪种菌株更适合用于人工瘤胃发酵？提示 J4 菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高，更适合用于人工瘤胃发酵。1选择培养基的制作思路(1)在培养基全部营养成分具备的前提下，加入物质：如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出
22、来；在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，但不影响酵母菌和霉菌的生长，从而可将这两种菌分离出来。(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中缺乏有机碳源时，自养微生物可利用空气中的 CO2制造有机物生存，而异养微生物则无法生存。(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物生长，使能够利用石油的微生物生长，从而分离出能消除石油污染的微生物。(4)通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度较高时易失水而不能生存；在高
23、温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。2两种纯化细菌方法的辨析比较项目 平板划线法 涂布平板法关键操作接种环在固体平板培养基表面连续划线一系列的梯度稀释涂布平板法操作注意事项每次划线前后均需灼烧接种环稀释度要足够高，为确保实验成功可以适当增加稀释度的范围菌体获取在具有显著菌落特征的区域的菌落中挑取菌体从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体优点可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落既可以获得单细胞菌落，又能对微生物进行计数缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板11命题点一 选择培养基成分及配制方法的分析1(2018全国，37)将马铃薯去皮切块
24、，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到 M培养基。回答下列问题：(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制_的生长，加入了链霉素的培养基属于_培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有_(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有_(答出两点即可)。(3)若在 M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是_，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_。(4)甲、乙两位同学用涂布平板
25、法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了 3个平板，统计的菌落数分别是 110、140 和 149，取平均值 133；乙同学涂布了 3个平板，统计的菌落数分别是 27、169 和 176，取平均值 124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是_。答案 (1)细菌 选择 (2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸(3)稀碘液 淀粉遇稀碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈 (4)乙同学的结果中，1 个平板的计数结果与另 2个相差悬殊，结果的重复性差解析 (1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在 M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可
26、筛选出真菌。(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等，故所加入的氮源可参与以上物质的合成。(3)淀粉遇碘变蓝，向加有淀粉的培养基中加入稀碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。(4)统计菌落数时一般选择菌落数在 30300 个的平板，甲同学统计的 3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的 3个平板中，1 个平板的计数结果与另 2个相差悬殊，结果的重复性差。2苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生12的废水中
27、含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，为土壤样品。请据图回答下列问题：(1)中培养目的菌株的选择培养基中应加入_作为碳源，中不同浓度碳源的培养基_(填“影响”或“不影响”)细菌的数量，如果要测定中活细菌数量，常采用_法。(2)为对照，微生物在中不生长，在中生长，与培养基的主要区别在于_。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是_。(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？_。答案 (1)苯酚 影响 涂布平板菌落计数 (2)的培养基中没有加入苯酚作为碳源，的培养基中加入了苯酚作为碳源 防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染
28、培养基 (3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作解析 (1)选择只能降解利用苯酚的细菌的培养基是以苯酚为唯一碳源的培养基；苯酚是唯一的碳源，当苯酚消耗尽时，菌株因缺少碳源而不能继续繁殖，所以中不同浓度的碳源会影响细菌数量；一般采用涂布平板菌落计数法来测定中活菌数目。(2)与培养基的主要区别在于的培养基中没有加入苯酚作为碳源，的培养基中加入了苯酚作为碳源；采用固体平板培养细菌时要倒置培养，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。(3)从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要进行无菌操作。无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。获得纯净培养物的关键是防止外来杂
29、菌的入侵：a.实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；c.为避免周围环境中微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；d.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。命题点二 微生物分离与计数的实例分析3(2018山东、湖北部分重点中学高考冲刺模拟)从土壤中分离尿素分解菌和纤维素分解菌，具有下列类似的操作过程：13(1)在过程的选择培养基是_培养基(填“固体”或“液体”)，过程的选择培养基是_培养基(填“固体”或“液体”)。的具体操作是_；的具体操作是_。(2)在过程样品梯度稀释后，一般只将稀释度为 10410 6倍
30、的菌液分别接种到 3个平板培养基上。接种的常用方法为_。(3)过程采用_的鉴别方法较简单。周围出现透明圈但不能 100%确定为纤维素分解菌的菌落，原因是_。答案 (1)固体 液体 以尿素为唯一氮源 以纤维素为唯一碳源 (2)涂布平板(或平板划线)法 (3)倒平板时加入刚果红染液 不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈解析 (1)将微生物接种在固体培养基上培养，才能形成菌落，可见，过程的选择培养基是固体培养基。进行梯度稀释并接种前要进行过程所示的选择培养，因此过程的选择培养基是液体培养基。选择培养的目的是筛选尿素分解菌，所以具体的操作是以尿素为唯一氮源；选择培养的目的是筛选纤维
31、素分解菌，所以的具体操作是以纤维素为唯一碳源。(2)常采用涂布平板(或平板划线)法将稀释度为 10410 6倍的菌液分别接种到 3个平板培养基上。(3)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。可见，过程采用倒平板时加入刚果红染液的鉴别方法较简单。由于不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈，所以周围出现透明圈的菌落，不能 100%确定为纤维素分解菌的菌落。4(2018通州高三第二次诊断)北方每年在小麦丰收的季节，焚烧秸秆火焰四起，烟雾
32、弥漫，不但导致严重的雾霾而且造成资源的浪费。科学家为了解决这个问题，努力寻找分解秸秆中纤维素的微生物，他们做了如下实验，据图回答： 从 森 林 里 取 土 壤 样 本 选 择 培 养 梯 度 稀 释将 样 品 接 种 到 鉴 别 纤 维素 分 解 菌 的 培 养 基 上挑 选 产 生 透 明 圈 的 菌 落 ， 统 计并 计 算 每 克 样 品 中 的 细 菌 数甲14(1)根据甲图，选择培养纤维素分解菌要用_。为了统计样品中活菌的数目，常用方法除涂布平板法外，还有_的方法。(2)乙图是培养出的单菌落示意图，最适合分解秸秆的两个菌落是_(填数字)，纤维素分解菌将纤维素最终分解为_。从图中可以看
33、出培养基上菌落数较少，推测可能的原因是_。(3)为了长期保存该微生物，可以采用_的方法。答案 (1)选择培养基 显微镜直接计数 (2)1 和 4 葡萄糖 土壤中纤维素分解菌较少，稀释的倍数太大 (3)甘油管藏解析 (1)从土壤样液中筛选能分解纤维素的细菌所用的培养基是选择培养基。统计样品中活菌的数目，常用涂布平板法或显微镜直接计数的方法。(2)透明圈的大小反映了细菌分解纤维素的能力大小，所以乙图中最适合分解秸秆的两个菌落是 1和 4；纤维素是多糖，最终被纤维素分解菌分解成葡萄糖；从图中可以看出培养基上菌落数较少，推测可能是土壤中纤维素分解菌较少，稀释的倍数太大所致。(3)长期保留菌种可用甘油管
34、藏的方法。矫正易错 强记长句1灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。2划线时最后一区不要与第一区相连。3划线时用力大小要适当，这是为了防止用力过大将培养基划破。4用涂布平板菌落计数法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。5尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：151图甲是利用平板划线法进行微生物接种，图乙是利用涂布平板法进行微生物接种。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次
35、是灼烧灭菌和酒精消毒。2接种操作在火焰附近进行的原因是火焰附近为无菌区域。3接种后，在固体培养基上培养细菌时进行倒置培养的目的是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基重温高考 演练模拟1(2016江苏，25)漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是(多选)( )A生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品B筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落C在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化D斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株答案 BC解析 漆酶降解“木质” ，则漆
36、酶菌株多存在于“木质”丰富的场所，生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A 错误；产漆酶菌株可降解木质素，在筛选培养基中加入木质素可筛选产漆酶的菌株，筛选时可通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，B 正确；在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化，C 正确；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D 错误。2(2018江苏，31)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：16(1)配制培养基时
37、，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的_，及时对培养基进行分装，并进行_灭菌。(2)取步骤中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤中将温度约_(在 25、50或 80中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤所示进行划线。下列叙述合理的有_。a为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌b划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落c挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量d可以通过逐步提高培养基中的甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株(4)步骤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和_
38、供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释 1000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用 2516型血细胞计数板计数 5个中格中的细胞数，理论上_色细胞的个数应不少于_，才能达到每毫升 3109个活细胞的预期密度。答案 (1)pH 高压蒸汽(湿热) (2)50 (3)a、b、d(4)氧气 无 30解析 (1)配制培养基时，进行计算、称量、溶化、定容后，需先调 pH再分装到锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌。(2)倒平板时的培养基温度约为 50，冷凝后倒置培养。(3)平板划线时，接种针、接种环使用前和每次划线后都需要进行灼烧灭菌，以免造成杂菌污染，a 正确；划线时不能划破培养基表面，否则不能形成正常菌落，b
39、正确；挑取菌落时，应挑取多个不同的菌落，分别测定酵母细胞中蛋白质含量，c 错误；逐步提高培养基中甲醇的浓度，能筛选出其中的耐受菌，获得甲醇高耐受菌株，d 正确。(4)酵母是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下可大量繁殖。酵母扩大培养时，需保证充足的营养和氧气等条件。由题中信息“经等体积台盼蓝染液染色”可知，计数室中培养液容积实际只有 0.120.05mm 3。设 5个中方格中无色(活细胞不能被台盼蓝染色)的细胞数目为 x个，则3109x/525100010000.05，解得 x30(个)。173(2017江苏，31)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从
40、处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K 2HPO4、MgSO 4、苯酚和水，其中可作为碳源的有_。(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐_，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步_，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加_。(3)如图为连续划线法示意图，在图中_(填图中序号)区域更易获得单菌落。(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中 15 号比色管的苯酚浓度应分别为_。管号 1 2 3 4
41、 5 6苯酚浓度(mg/L) 1如果废水为 50mg/L苯酚溶液，降解后约有 21%的苯酚残留，则需将残留液稀释_(填序号：5 10 20)倍后，再进行比色。答案 (1)蛋白胨、苯酚 (2)增加 稀释涂布 凝固剂(3) (4)0、0.2、0.4、0.6、0.8 解析 (1)含碳有机物如蛋白胨、苯酚均可作为异养型细菌的碳源。(2)为达到富集苯酚降解菌的目的，培养过程中随转接次数增加，应逐渐提高苯酚用量。若平板中菌落过于密集，为便于分离计数，则应进一步稀释涂布；进行分离计数应制备“固体”培养基，故平板培养基中除需水、营养物质外，还需添加凝固剂。(3)连续划线法分离菌种时，在最后的划线区，菌种分散最
42、充分，最宜获得单菌落。(4)制作系列浓度梯度进行显色反应应设置无菌水作对照组(苯酚浓度为 0)，并设置等差密度梯度，故 15 号比色管的苯酚浓度依次为 0、0.2、0.4、0.6、0.8。若废水为 50mg/L苯酚溶液，降解后约有 21%的苯酚残留，则残留液中苯酚浓度为 10.5 mg/L，宜将其稀释 20倍18方可达到适宜比色管苯酚浓度。一、选择题1(2018苏州高三一模)下列有关微生物培养的叙述正确的是( )A通常使用液体培养基分离获得细菌单菌落B若培养基需要调节 pH，应该在灭菌后进行C用显微镜直接计数固体培养基中微生物数量D倒置平板可防止培养基被滴落的冷凝水污染答案 D解析 常用固体或
43、半固体培养基分离获得细菌单菌落，液体培养基无法分离，A 错误；若培养基需要调节 pH，应该在灭菌前进行，B 错误；显微镜直接计数法是测定培养液中微生物数量的方法，固体培养基上用涂布平板法直接计数单个菌落数，C 错误；倒置平板是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，D 正确。2下面是微生物平板划线示意图，划线的顺序为 1、2、3、4、5。下列叙述正确的是( )A在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌B划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上C接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的D第 1区和第 5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数答案 C解析 在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，但不能对培养基进行灭菌，A 错误；进行划线操作时，左手将培养皿的皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖，B 错误；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的，C 正确；第 1区和第 5区的划线不能相连，D 错误。3给无氮培养基接种土壤稀泥浆的正确方法是( )A打开培养皿盖，取一根接种环沾取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上B取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点C打开培养皿盖，取一根接种
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