1、- 1 -DNA 重组技术的基本工具一、基因工程的概念及其诞生与发展1基因工程的概念填表别名 DNA 重组技术操作环境 生物体外操作对象 基因操作水平 DNA 分子水平结果 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品2基因工程的诞生和发展(1)基础理论的突破：DNA 是遗传物质的证明；DNA 双螺旋结构和中心法则的确立；遗传密码的破译。(2)技术的发明：基因转移载体和工具酶的相继发现；DNA 合成和测序技术的发明；DNA体外重组的实现及重组 DNA 表达实验的成功；第一例转基因动物的问世及 PCR 技术的发明。二、DNA 重组技术的基本工具1限制性核酸内切酶(又称限制酶)(1)来源：主要来自原核生
2、物。(2)功能：能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。1.基因工程的基本原理是基因重组，外源 DNA 能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。2DNA 重组技术的基本工具有限制性核酸内切酶、DNA 连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。3限制性核酸内切酶可识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。4Ecoli DNA 连接酶只能连接黏性末端，而 T4DNA 连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端。5质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标
3、记基因。6在基因工程中使用的载体除质粒外，还有 噬菌体的衍生物、动植物病毒等。- 2 -(3)结果：产生黏性末端或平末端。(4)应用：已知限制酶 EcoR和 Sma识别的碱基序列和酶切位点分别为 G AATTC 和CCC GGG，在图中写出两种限制酶切割 DNA 后产生的末端并写出末端的种类。EcoR限制酶和 Sma限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。2DNA 连接酶(1)作用：将双链 DNA 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)种类：填表种类比较 Ecoli DNA 连接酶 T4DNA 连接酶来源 大肠杆菌
4、T4噬菌体特点 只能连接黏性末端 既可以连接黏性末端，又可以连接平末端3基因进入受体细胞的载体(1)种类常用载体：质粒Error!其他载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(2)作用作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(3)载体须具备的条件及其作用(连线)三、重组 DNA 分子的模拟操作1所用材料用具中，剪刀代表 EcoR，透明胶条代表 DNA 连接酶。2用剪刀进行 DNA“切割”时，应找出 GAATTC 序列并在 GA 之间作切口进- 3 -行“切割” 。3若操作正确，不同颜色的黏性末端能互补配对。1基因工程是一种新兴的生物技术，实施该工程的最
5、终目的是( )A定向提取生物体的 DNA 分子B定向对 DNA 分子进行人工“剪切”C在生物体外对 DNA 分子进行改造D定向改造生物的遗传性状解析：选 D 基因工程也称 DNA 重组技术，它是按照人类的意愿，将某种基因有计划地转移到另一种生物中去的新技术，故实施基因工程的最终目的是定向改造生物的遗传性状。2下列关于限制酶的说法，正确的是( )A限制酶广泛存在于各种生物中，其化学本质是蛋白质B一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C不同的限制酶切割 DNA 后都会形成黏性末端D限制酶均特异性地识别由 6 个核苷酸组成的序列解析：选 B 限制酶主要存在于微生物中；限制酶具有专一性，即一种限制酶只
6、能识别一种特定的核苷酸序列；不同的限制酶切割 DNA 后会形成黏性末端或平末端；限制性核酸内切酶均能特异性地识别核苷酸序列，但识别的核苷酸序列不一定由 6 个核苷酸组成。3 “分子缝合针”DNA 连接酶“缝合”的部位是( )A碱基对之间的氢键B碱基与脱氧核糖C双链 DNA 片段间的磷酸二酯键D脱氧核糖与脱氧核糖解析：选 C 相邻的两个脱氧核苷酸之间由磷酸和脱氧核糖形成的磷酸二酯键连接，DNA连接酶连接的是此化学键。4下列通常不被用作基因工程载体的是( )A细菌质粒 B 噬菌体的衍生物C动植物病毒 D细菌核区的 DNA解析：选 D 常用的载体有质粒、 噬菌体的衍生物、动植物病毒等。细菌的核区由一
7、个大型的环状 DNA 分子经反复折叠缠绕而成，它控制着细菌的主要性状，一般不能用作基因工程的载体。5质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是( )A质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有- 4 -B质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切点C质粒为小型环状 DNA 分子，存在于拟核(区)外的细胞质基质中D质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制解析：选 A 质粒为小型环状 DNA 分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒；质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点；质粒为小型环状 DNA 分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中；质粒能够
8、在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制。Error!核 心 要 点 一 基 因 工 程 中 的 工 具 酶1限制性核酸内切酶(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面能够识别双链 DNA 分子中特定的核苷酸序列。能够切割特定序列中的特定位点。(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链 DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。如 Error!以 为轴，两侧碱基互补对称。GCCG AT(3)作用产物：黏性末端或平末端。黏性末端：是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将 DNA 的两条链分别切开时形成的，如图所
9、示：平末端：是限制性核酸内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：2限制性核酸内切酶与 DNA 连接酶的关系- 5 -(1)区别：作用 应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在 DNA 片段之间重新形成磷酸二酯键 用于目的基因和载体的连接(2)两者的关系可表示为：3DNA 连接酶与 DNA 聚合酶的比较比较项目 DNA 连接酶 DNA 聚合酶相同点 作用实质相同，都是催化磷酸二酯键的形成是否需要模板 不需要 需要接 DNA 链 双链 单链作用过程在两个 DNA 片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的 DNA 单链片段上，形成磷酸
10、二酯键作用结果将已存在的 DNA 片段连接合成新的 DNA 分子不同点用途 基因工程 DNA 复制题组冲关1下列关于几种酶作用的叙述，错误的是( )ADNA 连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接BRNA 聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录C一种限制酶能识别多种核苷酸序列，并切割出多种目的基因DDNA 聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条 DNA 单链解析：选 C 限制酶具有专一性，一种限制酶一般只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割 DNA 分子。DNA 连接酶能使不同 DNA 片段的脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接，重新形成 DNA 分子；RNA 聚合酶能与基因的特定
11、位点结合，催化遗传信息的转录；DNA 聚合酶能以 DNA 的一条链为模板，把单个脱氧核苷酸分子连接成一条 DNA 单链，复制形成新的 DNA分子。2(江苏高考改编)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：- 6 -限制酶 BamH Bcl Sau3A Hind识别序列及切割位点图 1图 2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。(2)若 BamH酶切的 DNA 末端与 Bcl酶切的 DNA 末端连接，连接部位的 6 个碱基对
12、序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能” “都不能”或“只有一种能”)切开。(3)若用 Sau3A切图 1 质粒最多可能获得_种大小不同的 DNA 片段。解析：(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个”的基本原则，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为 Bcl和 Hind，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过 DNA 连接酶的作用形成重组质粒。(2)因为 Bcl和 B
13、amH酶切产生的黏性末端相同，所以可以被 DNA 连接酶连接，连接部位的 6 个碱基对序列为 ，但是连接后形成的 DNA 中不再具有 BclT GATC CA CTAG G(G GATC AC CTAG T)和 BamH的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。(3)由图可知，能被限制酶 Bcl和BamH切割的序列也能被 Sau3A识别并切割，因此图中质粒上存在 3 个 Sau3A的切割位点，若将 3 个切割位点之间的 DNA 片段分别编号为 a、b 和 c，则完全酶切(3 个切割位点均被切割)会产生 3 种大小的 DNA 片段，即为 a、b 和 c；考虑只切 1 个切割位点，有三种情况，都产生
14、一种大小的 DNA 片段，即大小均为 abc；考虑切 2 个切割位点，则会产生ab、c、ac、b、bc、a 几种不同大小的 DNA 片段。综上所述，若用 Sau3A识别并切割图中质粒，最多可获得 7 种大小的 DNA 片段，即为- 7 -abc、ab、ac、bc、a、b、c。答案：(1) Bcl和 Hind DNA 连接(2) 都不能 (3)7T GATC CA CTAG G(G GATC AC CTAG T)方法规律限制酶的选择技巧根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 Pst；不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能
15、选择 Sma；为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 Pst和 EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端；质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶 Sma会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不只一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制Error!核 心 要 点 二 基 因 工 程 中 的 载 体1种类(1)常用载体
16、：质粒，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核 DNA 之外，具有自我复制能力的很小的双链环状 DNA 分子。(2)其他载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒等。2具备条件(1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体 DNA 上，随染色体- 8 -DNA 进行同步复制。(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入。(3)具有标记基因：具有特殊的标记基因，供重组 DNA 的鉴定和选择。(4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。3作用(1)用它作为运输工具，将目的基因送入受体细胞中。(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。名师点
17、拨 细胞膜上的载体与基因工程中的载体不同(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、 噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车” ，把目的基因导入受体细胞。题组冲关3限制酶 Mun和限制酶 EcoR的识别序列及切割位点分别是 CTTAAG 和 GAATTC。如图表示的是四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是( )解析：选 A 目的基因两侧有 Mun和 EcoR两种限
18、制酶的识别序列，用这两种酶切割都可得到目的基因，且未破坏标记基因的结构；B 中质粒无标记基因，不符合作为载体的条件；C、D 中的标记基因都会被破坏。4(全国卷)某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入到 Ampr或 Tetr中会导致相应的基因失活( Ampr表示氨苄青霉素抗性基因， Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用 BamH酶切获得的目的基因混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列
19、问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。- 9 -(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自_。解析：(1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源 DN
20、A 片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体 DNA 上，随染色体 DNA 进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组 DNA 的鉴定和选择等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其 DNA 复
21、制所需的原料来自受体细胞。答案：(1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞方法规律载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：- 10 -随
22、堂基础巩固 1以下有关基因工程的叙述，正确的是( )A基因工程是细胞水平上的生物工程B基因工程的产物对人类都是有益的C基因工程育种的优点之一是目的性强D基因工程产生的变异属于人工诱变解析：选 C 基因工程是在生物体外，通过对 DNA 分子进行人工“剪切”和“拼接” ，对生物的基因进行有目的地改造，然后导入受体细胞内，使目的基因在受体细胞内成功表达，产生人类所需要的基因产物。因而基因工程是分子水平上的生物工程，其产生的变异属于基因重组，而不属于人工诱变；基因工程虽是按照人们的意愿改造生物，目的性强，但并不是所有的基因产物对人类都有益。2有关 DNA 重组技术中的工具“分子缝合针” “分子手术刀”
23、 “分子运输车”的组合正确的是( )DNA 连接酶 DNA 聚合酶 限制酶RNA 聚合酶 载体A BC D解析：选 C 基因工程中， “手术刀”是限制酶， “缝合针”是 DNA 连接酶， “运输车”是指将目的基因导入受体细胞的载体。3下列有关限制性核酸内切酶的叙述，正确的是( )A用限制性核酸内切酶切割一个 DNA 分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有 2 个B限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在 DNA 中出现的概率就越大C. 和 序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同D只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒解析：选 B 用限制酶切割 DNA
24、 分子中部获得一个目的基因时，需剪切 2 次，水解磷酸二酯键 4 个；限制酶识别序列越短，则该序列在 DNA 中出现的概率就越大； 和序列被限制酶切出的黏性末端均有 4 个碱基；切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶，如果不同的限制酶切割 DNA 分子所产生的末端存在互补关系，则两末端也可连接。4下列关于 DNA 连接酶作用的叙述，正确的是( )- 11 -A将单个核苷酸加到某个 DNA 片段的末端，形成磷酸二酯键B将断开的 2 个 DNA 片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键C连接 2 条 DNA 链上碱基之间的氢键D只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末
25、端进行连接解析：选 B DNA 连接酶和 DNA 聚合酶都能催化磷酸二酯键的形成，但 DNA 连接酶是在2 个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键，将 2 个 DNA 片段连接成重组 DNA 分子；DNA 聚合酶则是将单个的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的 DNA 分子。5下列四条 DNA 片段，可能是由同一种限制酶切割而成的是( )A B C D解析：选 D 只有和的黏性末端的碱基都是互补的，它们可能是由同一种限制酶切割而成的。6下列有关基因工程和酶的叙述，正确的是( )A同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性B载体的化学本质与载体蛋白相同C限制酶不
26、能切割烟草花叶病毒的核酸DDNA 连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键解析：选 C 一种限制酶可识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子，因此具有专一性。载体有质粒、 噬菌体的衍生物和动植物病毒等，成分不单一；载体蛋白的本质是蛋白质。烟草花叶病毒的核酸为 RNA，限制酶不能切割。DNA 连接酶可催化两个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键。7根据图表的内容回答问题：几种限制酶识别序列切割位点限制酶 Sma EcoR Pst切割位点(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用 EcoR和 Pst酶切含有目的基因的 DNA，能得到_种 DNA 片段。如果将质粒载体和含目的基
27、因的 DNA 片段只用- 12 -EcoR酶切，酶切产物再加入 DNA 连接酶，其中由两个 DNA 片段之间连接形成的产物有_、_、_。(2)为了防止目的基因和质粒表达载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是_、_。解析：(1)含目的基因的 DNA 分子上含有 2 个 EcoR和 1 个 Pst的酶切位点，3 个切点全部切开，则形成 4 种 DNA 片段。质粒与含目的基因的 DNA 片段都用 EcoR 切割，目的基因两端和质粒切口处的黏性末端相同，只考虑两个 DNA 片段相连，则会形成 3 种连接产物，即质粒与质粒相连、质粒与目的基因相连、目的基因与目的基因相连。(2)为了防止任意连接，
28、可选用 EcoR和 Sma两种酶同时切割。答案：(1)4 质粒载体质粒载体连接物 目的基因目的基因连接物 质粒载体目的基因连接物 (2) EcoR Sma课时跟踪检测 一、选择题1下图为 DNA 分子的某一片段，其中分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是( )ADNA 连接酶、限制酶、解旋酶B限制酶、解旋酶、DNA 连接酶C解旋酶、限制酶、DNA 连接酶D限制酶、DNA 连接酶、解旋酶解析：选 C 解旋酶可催化碱基之间氢键()的断裂，限制酶可使两个核苷酸之间的磷酸二酯键()断开，而 DNA 连接酶则催化磷酸二酯键()的形成。2下列关于 DNA 重组技术基本工具的说法，正确的是( )ADNA
29、 连接酶只能连接双链 DNA 片段互补的黏性末端B微生物中的限制性核酸内切酶对自身 DNA 无损害作用C限制酶切割 DNA 后一定能产生黏性末端D质粒是基因工程中唯一的载体解析：选 B DNA 连接酶分为两类： Ecoli DNA 连接酶和 T4DNA 连接酶，前者只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端连接起来，而后者既可以连接双链 DNA 片段互补的黏性末端，也可以连接双链 DNA 片段的平末端。细菌内的限制酶能限制异源 DNA 的侵入并使之失活，即能将外源 DNA 切断，从而保护自身的遗传特性。限制酶切割 DNA 后，产生的末端有黏性末端和- 13 -平末端两种。质粒是常用的载体，除此之外
30、，基因工程中用到的载体还有 噬菌体的衍生物和动植物病毒等。3玉米的 PEPC 酶固定 CO2的能力较水稻的强 60 倍。我国科学家正致力于将玉米的PEPC 基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该应用技术的叙述，错误的是( )A该技术是在 DNA 水平上进行设计和施工的B该技术的操作环境是生物体内C该技术的原理是基因重组D该技术的优点是定向产生人类需要的生物类型解析：选 B 由题意可知，该技术为基因工程，是在生物体外进行的操作。4基因工程在操作过程中需要限制酶、DNA 连接酶、载体三种工具。以下有关基本工具的叙述，正确的是( )A所有限制酶的识别序列均由 6 个核苷酸组成B所有 DNA 连接
31、酶均能连接黏性末端和平末端C真正被用作载体的质粒都是天然质粒D原核生物内的限制酶可切割入侵的 DNA 分子而保护自身解析：选 D 大多数限制酶的识别序列由 6 个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由 4、5 或 8 个核苷酸组成；DNA 连接酶包括 Ecoli DNA 连接酶和 T4DNA 连接酶，前者只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端连接起来；在基因工程操作中真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。5质粒是基因工程最常用的载体，下列关于质粒的说法正确的是( )A质粒在宿主细胞内都要整合到染色体 DNA 上B质粒是独立于细菌拟核 DNA 之外的小型细胞器C基因工程使
32、用的质粒一定含有标记基因和复制原点D质粒上碱基之间数量存在 AGUC解析：选 C 基因工程使用的载体需有一至多个酶切位点，具自我复制的能力，有标记基因，对受体细胞安全，且分子大小适合。质粒进入宿主细胞后不一定都要整合到染色体DNA 上，如宿主细胞是细菌细胞则不需整合。质粒是小型环状双链 DNA 分子而不是细胞器，也不会有碱基 U。6图 1 表示 DNA 的基本结构，图 2 表示染色体 DNA 的片段，箭头是某种限制酶的识别序列和作用位点，下列相关说法正确的是( )- 14 -A图 1 中 a 所示部位即图 2 中箭头所示部位B图 2 所示的 DNA 片段被限制酶切割后获得的末端形式与图 1 下
33、端相同C Ecoli DNA 连接酶可以将两个图 1 所示结构连接成为一个 DNA 片段D基因工程的载体必须具有图 2 所示的碱基序列解析：选 A 图 2 箭头所示的部位表示两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，图 1 中 a 部位是磷酸二酯键；图 2 所示的 DNA 片段被限制酶切割后将获得黏性末端，而图 1 所示的 DNA具有的末端是平末端； Ecoli DNA 连接酶只可以“缝合 ”双链 DNA 片段的黏性末端，图 1所示为平末端；限制酶有多种，基因工程中的载体具有其中一个或几个限制酶识别的序列即可，不必一定含有图 2 所示的碱基序列。7某线性 DNA 分子含有 3 000 个碱基对(bp)，
34、先用限制酶 a 切割，再把得到的产物用限制酶 b 切割，得到的 DNA 片段大小如下表。限制酶 a 和 b 的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是( )a 酶切割产物(bp) b 酶再次切割产物(bp)1 600；1 100；300 800；300A在该 DNA 分子中，a 酶与 b 酶的识别序列分别有 3 个和 2 个Ba 酶与 b 酶切出的黏性末端不能相互连接Ca 酶与 b 酶切断的化学键不相同D用这两种酶和 DNA 连接酶对该 DNA 分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，Error!序列会明显增多解析：选 D a 酶切割后形成 3 个片段，说明 a 酶的切割位点有 2 个
35、，则识别序列有 2个；b 酶切割 a 酶的切割产物后得到 800 bp、300 bp 的片段，说明在 a 酶的产物中，1 600 bp 中有一个切割位点，被切成两个 800 bp 片段，1 100 bp 中有一个切割位点，被切成 800 bp 片段和 300 bp 片段，即 b 酶的识别序列有 2 个。a 酶与 b 酶切出的黏性末端可互补，因而能相互连接。a 酶与 b 酶切断的化学键均为磷酸二酯键。a 酶切割后形成的黏性末端为：Error! Error!b 酶切割后形成的黏性末端为：Error! Error!当用这两种酶和 DNA 连接酶对该 DNA 分子进行反复切割、连接操作后，和、和的连接
36、产物会增多。8下面是四种不同质粒的示意图，其中 ori 为复制必需的序列， amp 为氨苄青霉素抗性基因， tet 为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性核酸内切酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组 DNA 的细胞，应选用的- 15 -质粒是( )解析：选 C A 项破坏了复制必需的序列。B 项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。C 项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D 项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏。9下表所示
37、为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，正确的是( )限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称识别序列和切割位点BamH ATCCGG Kpn GGTACC EcoR ATTCCA Sau3A ATCG Hind GT ACYR Sma CC GGCG 注：YC 或 T，RA 或 G。A限制酶切割后不一定形成黏性末端B限制酶的切割位点一定在识别序列的内部C不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D一种限制酶只能识别一种核苷酸序列解析：选 A 由表中信息可知， Hind能识别 4 种不同的核苷酸序列； Sau3A酶的切割位点在识别序列的外部； BamH酶与 Sau3A酶切割后能形
38、成相同的黏性末端； Sma酶切割后产生的是平末端。10对下图所示黏性末端的相关说法错误的是( )A甲、乙、丙黏性末端是由各自不同的限制性核酸内切酶催化产生的B甲、乙具相同的黏性末端，可形成重组 DNA 分子，但甲、丙之间不能CDNA 连接酶作用位点在 b 处，催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键D切割甲的限制性核酸内切酶不能识别由甲、乙片段形成的重组 DNA 分子解析：选 C 甲图表示在 G 和 A 之间进行剪切，乙图表示在 C 和 A 之间进行剪切，丙图表示在 C 和 T 之间进行剪切，因此三者需要不同的限制性核酸内切酶进行剪切；甲和乙的黏- 16 -性末端相同，能够通过碱基互补配对形成重组
39、 DNA 分子，但甲和丙不行；DNA 连接酶作用的位点是磷酸二酯键，乙图中的 a 和 b 分别表示磷酸二酯键和氢键；甲和乙形成的重组 DNA 分子相应位置的 DNA 碱基序列为 ，而甲图表示在 G 和 A 之间切割，所以该重组序列GAATTGCTTAAC不能被切割甲的限制性核酸内切酶识别。二、非选择题11下列是基因工程的有关问题，请回答：(1)限制性核酸内切酶可以识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并可以使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的_(填化学键名称)断裂，形成的末端总体可分为两种类型，分别是_。(2)目的基因和载体重组时需要的工具酶是_，与限制性核酸内切酶相比，它对所重组的 DN
40、A 两端碱基序列_(填“有”或“无”)专一性要求。(3)如图表示的是构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶的识别序列和切点是GGATCC，限制酶的识别序列和切点是GATC。分析可知，最好选择限制酶_切割质粒，限制酶_切割目的基因所在的DNA，这样做的好处分别是_、_。解析：(1)限制性核酸内切酶作用的化学键是磷酸二酯键。限制性核酸内切酶切割 DNA分子后形成平末端或黏性末端。(2)目的基因与载体连接需要用 DNA 连接酶。(3)限制酶的识别序列和切点是GGATCC，限制酶的识别序列和切点是GATC，用限制酶切割质粒只会破坏一个标记基因。答案：(1)磷酸二酯键 黏性末端和平末端 (2)D
41、NA 连接酶 无 (3) 酶切割质粒不会把两个标记基因都破坏 目的基因两端均有酶的识别序列12目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322 质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_。(2)pBR322 分子中有单个 EcoR限制酶作用位点， EcoR只能识别序列GAATTC，并- 17 -只能在 G 和 A 之间切割。若在某目的基因的两侧各有 1 个 EcoR的切点，请画出目的基因两侧被限制酶 EcoR切割后所形成的黏性末端：_。(3)pBR322 分子中另有单个的 BamH限制酶作用位点，现将
42、经 BamH处理后的质粒与用另一种限制酶 Bgl处理得到的目的基因，通过 DNA 连接酶作用恢复_键，成功获得了重组质粒，说明_。(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无 Ampr和 Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_。解析：(1)质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于筛选(鉴别)目的基因是否导入受体细胞。(2)同一种限制酶切割
43、 DNA 分子产生的黏性末端相同，根据题意可知：该目的基因两侧被限制酶 EcoR切割后所形成的黏性末端为：目的基因G AATTC G AATTCCTTAA G CTTAA G(3)DNA 连接酶催化两个 DNA 片段形成磷酸二酯键；而通过 DNA 连接酶作用能将两个 DNA分子片段连接，表明经两种限制酶( BamH和 Bgl)切割得到的 DNA 片段，其黏性末端相同。(4)由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素
44、，而经限制酶BamH作用后，标记基因 Tetr被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是 pBR322 质粒。答案：(1)筛选(鉴别)目的基因是否导入受体细胞(2)如下所示：目的基因G AATTC G AATTCCTTAA G CTTAA G(3)磷酸二酯 两种限制酶( BamH和 Bgl)切割得到的黏性末端相同(4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322 质粒13(全国卷)图(a)中的三个 DNA 片段上依次表示出了 EcoR 、 BamH 和 Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、 Sau3A的切点
45、是唯一的)。- 18 -图(b)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经 BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。图(c)(3)DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。解析：(1)由题图可知， BamH和 Sau3A两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经 BamH酶切得到的目的基因可以GATCCTAG与图(b)所示表达载体被 Sau3A酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图(c)中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的 DNA连接酶有 Ecoli DNA 连接酶
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