DB34 T 1364-2011 Determination of Methyltestosterone in feed-High performance liquid chromatography《饲料中甲基睾丸酮的测定-高效液相色谱法》.pdf

1、ICS 65.120 B 46 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 13642011 饲料中甲基睾丸酮的测定-高效液相色谱法Determination of Methyltestosterone in feed -High performance liquid chromatography 2011 - 03 - 16 发布 2011 - 04 - 16 实施安徽省质量技术监督局 发布DB34/T 13642011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省畜牧兽医局提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省兽药饲料

2、监察所(安徽省畜产品质量安全检测中心)。 本标准主要起草人：刘发全、丁在亮、张莉、许世富、刘红云、明文庆、蔡东东。 DB34/T 13642011 1 饲料中甲基睾丸酮的测定-高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了以高效液相色谱（HPLC）测定饲料中甲基睾丸酮的方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中甲基睾丸酮的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样

3、 3 试样制备 按 GB/T 14699.1 采样，选取有代表性的饲料样品 500，四分法缩减至 100，磨碎，全部通过0.42 mm 孔径分析筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。 4 原理 试样中的甲基睾丸酮先用甲醇溶液提取，固相萃取柱净化，用高效液相色谱仪测定，以外标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。 5.2 甲基睾丸酮标准品：纯度不低于 98。 5.3 甲醇，色谱纯。 5.4 磷酸。 5.5 0.025 mol/L磷酸溶液：量取 1.8 mL磷酸加水定容至 1000 mL。 5.6 提取液

4、：甲醇：水=95:5。 5.7 洗脱液：甲醇：水=40:60。 5.8 固相萃取柱：中性氧化铝固相萃取柱 150 mg/6 mL。 5.9 甲基睾丸酮标准贮备液：500 g/mL。准确称取 50 mg 甲基睾丸酮标准品(精确至 0.0002 g 于100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇常温超声溶解，定容至刻度并摇匀，配制成标准贮备液，贮于 4 冰箱中，有效期 90 天。 DB34/T 13642011 2 5.10 甲基睾丸酮标准工作溶液：分别精确吸取(5.8)中标准贮备液 0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL 于 100 mL 棕色容量瓶中，用洗脱液液（5.6）定容，配制成

5、 0、1.0、2.5、5.0、 10、20、50 g/mL标准工作溶液。 5.11 流动相：甲醇：0.025 mol/L 磷酸溶液=70:30。 5.12 滤膜：0.45 m 有机滤膜。 6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器或紫外检测器。 6.2 分析天平：感量 0.0002 g。 6.3 真空泵(0.1 Mpa)。 6.4 恒温水浴锅。 6.5 离心机：5000 r/min。 6.6 超声波清洗机。 6.7 饲料粉碎机 7 分析步骤 7.1 提取 准确称取试样(配合饲料 5 g，浓缩饲料 2 g，复合预混合饲料 1 g，精确至 0.0002 g于离心管中，加入甲醇:水

6、溶液（5.5）25 mL，超声提取 30 分钟后，4 000 r/min 离心 10 min，上清液过滤备用。 7.2 净化 先分别用 3 mL 甲醇和 3 mL 水对固相萃取柱（5.7 ）对进行活化，取 7.1 制成的备用液 3.0 mL上小柱，控制过柱速度不超过 1.0 mL/min，用 3 m L 甲醇（5.6）洗脱，收集洗脱液过 0.45m 滤膜(5.11)，上机测定。 7.3 色谱条件 色谱柱：C 18 (4.6250 mm，5 m)，或相当的色谱柱； 检测波长：254 nm； 流速：1.0 mL/min； 进样体积：10 L。 7.4 上机测定 取标准工作液和样品试液分别注入高效液

7、相色谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。 8 结果计算与表述 按照下式计算试样中甲基睾丸酮的含量： 1000mAs1000VCsAX= . (1) 式中： DB34/T 13642011 3 X 试样中甲基睾丸酮的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； A 试样溶液对应的色谱峰面积响应值； As 标准溶液对应的色谱峰面积响应值； V 定容体积，单位为毫升（mL）； Cs 标准溶液的浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； m 试样质量，单位为克（g）。 平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 9 检测方法灵敏度、准确度、精密度 9.1 灵敏度 本方法饲料中甲基睾丸酮检测限为 1.0 mg/kg。 9.2 准确度 本方法在添加浓度为 2.0 mg/kg 的回收率为 80120。 9.3 精密度 本方法的批内变异系数 CV10，批间变异系数 CV15。 DB34/T 13642011 4 AA 附 录 A （资料性附录） 甲基睾丸酮标准品高效液相色谱图 图A.1 甲基睾丸酮标准品高效液相色谱图 _