DB51 T 1082-2010 《饲料中伏马毒素B1的测定 高效液相色谱法》.pdf

1、 ICS DB51备案号：28172-2010 四川省地方标准DB51/T 10822010饲料中伏马毒素 B 的测定 1高效液相色谱法 Determination of fumonisin B1in feeds High-performance liquid chromatography 2010-06-01 发布 2010-07-01 实施四川省质量技术监督局发布DB51/T 1082-2010 I 目 次 前 言II 1 范围1 2 规范性引用文件1 3 原理1 4 试剂和溶液1 5 仪器与设备2 6 试样制备2 7 分析步骤2 8 结果计算3 9 精密度3 附录 A 4 DB51/T

2、1082-2010 II 前 言 本标准的附录A 为资料性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省饲料工作总站负责起草。 本标准起草人：柏凡、李云、魏敏、王宇萍、赵立军、张静。DB51/T 1082-2010 1 饲料中伏马毒素B1的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了测定饲料中伏马毒素B1的含量的高效液相色谱法(HPLC) 。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及饲料原料的测定。 本标准中伏马毒素B1的检出限为0. 2mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本

3、文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1 饲料 采样 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样经甲醇-水提取，离心、过滤后，取滤液经过免疫亲和柱净化，经衍生化，用高效液相色谱仪-荧光检测器检测，外标法计算伏马毒素B1的含量。 4 试剂和溶液 除特殊说明外，所有试剂均为分析纯，色谱用水符合GB/T6682 一级用水的规定。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 乙酸：优级纯。 4.4 磷酸：优级纯。 4.5 盐酸。 4.6 氯化钠。 4.7 氯化钾。 4.8

4、 磷酸钠。 4.9 磷酸二氢钠。 4.10 磷酸氢二钠。 4.11 磷酸二氢钾。 4.12 氢氧化钠。 4.13 四硼酸钠：优级纯。 4.14 巯基乙醇：优级纯。 4.15 邻苯二甲醛：优级纯。 4.16 提取液：甲醇+ 水=80+20（体积比）。 4.17 衍生剂：称取 5mg 邻苯二甲醛，溶于 1mL 甲醇，用 0.05mol/L 四硼酸钠溶液定容到 50 mL，加入 25L 巯基乙醇，混匀，备用（4 可保存一周）。 4.18 磷酸盐缓冲液（PBS ）：称取 8.0g 氯化钠、1.44g 磷酸氢二钠、0.2g 磷酸二氢钾、0.2g 氯化钾，溶于 1000mL 水，用盐酸或氢氧化钠溶液调 p

5、H 至 7.0。 DB51/T 1082-2010 2 4.19 伏马毒素B1标准品：含量大于 98%。 4.19.1 标准贮备液：精密称取 10mg 伏马毒素 B1 标准品，用乙腈+ 水（1+1）溶解、定容至 100 mL，此贮备液浓度为 100 g/mL，置于 28 冰箱中保存，有效期 6 个月。 4.19.2 标准工作溶液：分别准确移取伏马毒素B1贮备液，用流动相配制成标准工作溶液：0.2 g/mL，1.0 g/mL，5.0 g/mL，25 g/mL，50 g/mL。置于 28 冰箱中保存，有效期 6 个月。 注意： 注1:凡接触伏马毒素B 1的容器，需浸入4%次氯酸钠（NaOCl ）溶

6、液，放置半天后清洗备用。 注2:为了安全，分析人员操作时须带上医用乳胶手套，在通风橱内操作。 4.19.3 伏马毒素免疫亲和柱。 5 仪器与设备 5.1 分析天平：感量 0.1 mg。 5.2 超声波清洗器。 5.3 离心机：转速为 5000 r/min 以上。 5.4 超纯水处理器。 5.5 涡旋混合器。 5.6 高效液相色谱仪：配备荧光检测器。 5.7 氮吹仪。 5.8 0.45 m 滤膜。 6 试样制备 按GB/T14699.1规定采集试样后，按GB/T20195 规定，选取具有代表性的实验室样品1kg ，四分法缩减分取200 g 左右，粉碎过1 mm 孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。 7

7、分析步骤 7.1 试样溶液的制备 7.1.1 提取 称取 20g 试样 (精确至 0.01g)于锥形瓶中，加入 2g 氯化钠（4.6 ），50mL 提取液（4.16 ），超声提取 20min，离心，取上清液过滤，准确量取滤液 5.0mL，加入 20mLPBS（4.18 ）稀释，混匀，待净化。 7.1.2 净化 将免疫亲和柱底帽除去。剪去亲和柱的盖帽，与10ml 注射器连接。待免疫亲和柱中缓冲液排出后，精确吸取上述稀释液5.0 mL过免疫亲和柱（流速1-2 滴 /秒），再依次用 5mLPBS缓冲液淋洗柱子，抽干柱子，用2.0mL 甲醇洗脱，收集洗脱液于50 水浴中氮气吹干，重新溶解于200 L的

8、甲醇+ 水（50+50 ，体积比）中，待衍生化。 7.1.3 衍生化 取样品处理液和标准溶液各100 L，各加300 L衍生剂（4.17 ），混匀，过0.45m 滤膜，在2min内上机测定。 7.2 色谱条件 7.2.1 色谱柱：C18柱，柱长 250mm，内径 4.6mm，粒度 5m；或性能相当的色谱柱。 7.2.2 柱温：30。 7.2.3 流动相：甲醇 + 磷酸二氢钠（0.1mol/L ，磷酸调节 pH 至 3.3）77+23（体积比）。 7.2.4 流速：0.8mL/min 。 7.2.5 检测器：荧光检测器，Ex ：330nm ， Em：440nm 。 7.2.6 进样量：50 L。

9、 DB51/T 1082-2010 3 7.3 测定 按上述色谱条件，分别将标准溶液和试样溶液上机测定，按照保留时间进行定性，单点或多点校正，外标法定量。当分析物浓度不在线性范围内时，应将分析物稀释或者浓缩后再进行检测。 8 结果计算 试样中伏马毒素B1的含量X，以质量分数毫克每千克(mg/kg) 表示，单点校正按式(1) 计算： nmAsVCsAX = (1) 式中： V上机定容体积，单位为毫升(mL) ； As伏马毒素B1标准溶液对应的色谱峰面积响应值； A试样溶液对应的色谱峰面积响应值； Cs伏马毒素B1标准溶液的浓度，单位为微克每毫升( g/mL)； m试样质量，单位为克(g) ； n稀释倍数。 结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性试验条件下两次平行测定结果的相对偏差不大于10% 。 DB51/T 1082-2010 4 附 录 A （资料性附录） 伏马毒素B 1标准色谱图 图A.1 伏马毒素B 1标准色谱图 _