1、NORME INTERNATIONALE ISO 6651 Troisime dition 2001-12-15 Numro de rfrence ISO 6651:2001(F) ISO 2001 Aliments des animaux Dosage semi- quantitatif de laflatoxine B 1 Mthodes par chromatographie sur couche mince Animal feeding stuffs Semi-quantitative determination of aflatoxin B 1 Thin-layer chromato
2、graphic methodsISO 6651:2001(F) ii ISO 2001 Tous droits rservs PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intgres. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peut tre imprim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi moins que lordinateur
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7、andeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.ch Web www.iso.ch I mp ri m e nS u i s s eISO 6651:2001(F) ISO 2001 Tous droits rservs iii Sommaire Page 1 Domaine dapplication 1 2 Rfrence normative 1 3 Principe . 1 4 Rac
8、tifs . 2 5 Appareillage 4 6 chantillonnage 5 7 Mode opratoire . 5 8 Calculs et expressions des rsultats 12 9 Essais interlaboratoires 12 10 Rapport dessai 13 Annexe A Rsultats des essais interlaboratoires 14ISO 6651:2001(F) iv ISO 2001 Tous droits rservs Avant-propos LISO (Organisation international
9、e de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet
10、. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont
11、 rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 3. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants
12、. Lattention est appele sur le fait que certains des lments de la prsente Norme internationale peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. L
13、a Norme internationale ISO 6651 a t labore par le comit technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,s o u s - comit SC 10, Aliments des animaux. Cette troisime dition annule et remplace la deuxime dition (ISO 6651:1987), dont elle constitue une rvision mineure. Lannexe A de la prsente Norme internati
14、onale est donne uniquement titre dinformation.NORME INTERNATIONALE ISO 6651:2001(F) ISO 2001 Tous droits rservs 1 Aliments des animaux Dosage semi-quantitatif de laflatoxine B 1 Mthodes par chromatographie sur couche mince 1 Domaine dapplication 1.1 La prsente Norme internationale spcifie deux mthod
15、es pour le dosage de laflatoxine B 1 dans les aliments des animaux. Ces mthodes se prtent uniquement aux dosages semi-quantitatifs. 1.2 Mthode A, applicable aux aliments simples suivants: graines olagineuses et tourteaux, en particulier darachide, de coprah, de lin, de soja, de ssame, de babassu; f
16、a rin edem an io c; tourteaux de germes de mas; crales et produits craliers; f a rin edep oi s; pulpe et fcule de pommes de terre. En prsence de substances interfrentes qui entravent les dterminations selon la mthode A, il est recommand deffectuer la dtermination selon la mthode B. 1.3 Mthode B, app
17、licable aux aliments composs ainsi quaux aliments simples non mentionns en 1.2. Cette mthode nest pas applicable aux aliments contenant des pulpes dagrumes. 2 Rfrence normative Le document normatif suivant contient des dispositions qui, par suite de la rfrence qui y est faite, constituent des dispos
18、itions valables pour la prsente Norme internationale. Pour les rfrences dates, les amendements ultrieurs ou les rvisions de ces publications ne sappliquent pas. Toutefois, les parties prenantes aux accords fonds sur la la prsente Norme internationale sont invites rechercher la possibilit dappliquer
19、ldition la plus rcente du document normatif indiqu ci-aprs. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document normatif en rfrence sapplique. Les membres de lISO et de la CEI possdent le registre des Normes internationales en vigueur. ISO 6498, Aliments des animaux Prparation des chantillons
20、 pour essai 3P r i n c i p e Extraction au chloroforme sur une prise dessai, filtration puis purification dune partie aliquote sur colonne de gel de silice. vaporation de lluat et dissolution du rsidu dans un volume dtermin de chloroforme ou dun mlange benzne- actonitrile. Chromatographie sur couche
21、 mince, monodimensionnelle pour la mthode A et bidimensionnelle pour la mthode B, dune partie aliquote de cette solution.ISO 6651:2001(F) 2 ISO 2001 Tous droits rservs Dtermination de la teneur en aflatoxine B 1 , par mesure visuelle ou laide dun fluorodensitomtre, de lintensit de fluorescence du ch
22、romatogramme examin la lumire UV, par comparaison avec des quantits connues dun talon daflatoxine B 1 plac sur la mme plaque que lchantillon. Confirmation de lidentit de laflatoxine B 1 par formation du driv hmiactal. 4 Ractifs Utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue et de leau
23、 distille ou dminralise ou de leau de puret quivalente. 4.1 Chloroforme, stabilis par dthanol (fraction volumique). 4.2 n-Hexane. 4.3 Oxyde dithylique, anhydre, exempt de peroxydes. 4.4 Benzne/actonitrile, mlange ). Mlanger 98 volumes de benzne avec 2 volumes dactonitrile. 4.5 Chloroforme/mthanol, m
24、lange ( ). Mlanger 97 volumes de chloroforme avec 3 volumes de mthanol. 4.6 Solvants de dveloppement. Il convient dutiliser les solvants dans des cuves couvertes. Lorsque des cuves satures sont spcifies, ceci est ralis en les recouvrant intrieurement avec du papier-filtre et en laissant la cuve se s
25、aturer avec les vapeurs de solvant. 4.6.1 Chloroforme/actone, mlange ). Mlanger 90 volumes de chloroforme avec 10 volumes dactone, en cuve non sature. 4.6.2 Oxyde dithylique/mthanol/eau, mlange ). Mlanger 96 volumes doxyde dithylique avec 3 volumes de mthanol et 1 volume deau, en cuve non sature. 4.
26、6.3 Oxyde dithylique/mthanol/eau, mlange ). Mlanger 94 volumes doxyde dithylique avec 4,5 volumes de mthanol et 1,5 volumes deau, en cuve sature. 4.6.4 Chloroforme/mthanol, mlange ( . Mlanger 94 volumes de chloroforme avec 6 volumes de mthanol, en cuve sature. 4.6.5 Chloroforme/mthanol, mlange ). Ml
27、anger 97 volumes de chloroforme avec 3 volumes de mthanol, en cuve sature. 4.7 Gel de silice, pour chromatographie sur colonne, granulomtrie: . 4.8 Gel de silice, G-HR ou quivalent, pour chromatographie sur couche mince. 4.9 Terre de diatomes (Hyflosupercel), lave lacide. 4.10 Sulfate de sodium,g r
28、an ul sa nh y dr es . 0,5 % 1,0 % 96 % (98 + 2 97 + 3 (90 + 10 (96 + 3 + 1 (94 + 4,5 + 1,5 94 + 6) (97 + 3 0,05 mm 0,20 mmISO 6651:2001(F) ISO 2001 Tous droits rservs 3 4.11 Acide trifluoroactique. 4.12 Gaz inerte, par exemple azote. 4.13 Acide sulfurique, solution (fraction volumique). 4.14 Aflatox
29、ine B 1 , solution talon contenant environ daflatoxine B 1 par millilitre dans le chloroforme (4.1) ou dans le mlange benzne/actonitrile (4.4). AVERTISSEMENT Les aflatoxines sont fortement cancrignes et doivent tre manipules avec beaucoup de prcaution. Prparer et contrler la solution comme indiqu ci
30、-aprs. 4.14.1 Prparation de la solution mre et dtermination de sa concentration Prparer une solution daflatoxine B 1 , dans le chloroforme (4.1) ou dans le mlange benzne/actonitrile (4.4), de concentration comprise entre et . Dterminer son spectre dabsorption entre et laide du spectromtre (5.9). Rel
31、ever labsorbance ( ) dans le cas dune solution chloroformique, ou dans le cas dune solution dans le mlange benzne/actonitrile. Calculer la concentration daflatoxine B 1 , en microgrammes par millilitre de solution, partir des formules suivantes: a) pour la solution chloroformique b) pour la solution
32、 dans le mlange benzne/actonitrile 4.14.2 Dilution Effectuer labri de la lumire les dilutions convenables de la solution mre (4.14.1) pour obtenir une solution talon dont la concentration en aflatoxine B 1 soit denviron . Conserve au rfrigrateur , cette solution est stable durant 2 semaines. 4.14.3
33、Contrle de la puret chromatographique de la solution Dposer sur une plaque (5.7) une tache de de la solution mre daflatoxine B 1 de concentration (4.14.1). Dvelopper le chromatogramme comme indiqu en 7.5.1. Sous lumire ultraviolette, la fluorescence ne doit donner lieu qu la perception dune seule ta
34、che et aucune fluorescence ne doit tre perue dans la zone du dpt dorigine. 4.15 Aflatoxines B 1 et B 2 (voir lavertissement en 4.14), solutions pour lessai qualitatif, contenant environ daflatoxines B 1 et B 2 par millilitre dans le chloroforme (4.1) ou dans le mlange benzne/actonitrile (4.4). Ces c
35、oncentrations sont donnes titre indicatif. Elles doivent tre ajustes de manire obtenir la mme intensit de fluorescence pour les deux aflatoxines (voir 7.5.1). 50 % 0,1 g 8 g/ml 10 g/ml 330 nm 370 nm A 363 nm 348 nm 312 A 1 000 22 300 312 A 1 000 19 800 0,1 g/ml 4 C 5l8 g/ml 10 g/ml 0,1 gISO 6651:200
36、1(F) 4 ISO 2001 Tous droits rservs 5 Appareillage Matriel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit. 5.1 Broyeur. 5.2 Tamis, de douverture de maille. Pour plus de dtails, voir lISO 565 1) . 5.3 Appareil secouer ou agitateur magntique. 5.4 Tube pour chromatographie, en verre (diamtre int
37、rieur , longueur ), avec robinet en polyttrafluorothylne (PTFE) et rservoir de , muni son extrmit dun tampon de coton ou de laine de verre. 5.5 Appareil rotatif vaporation sous vide, avec ballon fond rond de . 5.6 Appareillage pour chromatographie sur couche mince, savoir matriel ncessaire la prpara
38、tion des plaques (5.7) et au dpt des taches (pipettes capillaires ou microseringues), cuve de dveloppement et appareil pour pulvriser lacide sulfurique (4.13) sur les plaques. 5.7 Plaques de verre pour chromatographie sur couche mince, , prpares comme suit (les quantits indiques conviennent pour rec
39、ouvrir cinq plaques). Introduire de gel de silice (4.8) dans une fiole conique, ajouter deau, boucher et agiter durant . tendre la suspension sur les plaques, de manire obtenir une couche uniforme de dpaisseur. Laisser scher lair et conserver ensuite dans un dessiccateur garni de gel de silice. Au m
40、oment de lemploi, activer les plaques en les maintenant durant dans une tuve . Les plaques prtes lemploi conviennent dans la mesure o elles donnent des rsultats semblables ceux des plaques prpares comme indiqu ci-dessus. 5.8 Lampe ultraviolet ondes longues ( ). L intensit dirradiation doit permettre
41、 de distinguer encore nettement une tache de daflatoxine B 1 sur une plaque pour chromatographie sur couche mince, une distance de de la lampe. AVERTISSEMENT La lumire ultraviolette tant dangereuse pour les yeux, il y a lieu de porter des lunettes protectrices. 5.9 Spectromtre, permettant deffectuer
42、 les mesures dans lultraviolet. 5.10 Fluorodensitomtre (ventuellement). 5.11 Papier-filtre plis. 5.12 Tube gradu, de de capacit, avec bouchon de polythylne. 5.13 Fiole conique, de de capacit, bouchon rod. 5.14 Pipette, de de capacit. 5.15 Balance analytique. 1) ISO 565, Tamis de contrle Tissus mtall
43、iques, tles mtalliques perfores et feuilles lectroformes Dimensions nominales des ouvertures. 1,0 mm 22 mm 300 mm 250 ml 500 ml 200 mm 200 mm 30 g 60 ml 1 min 0,25 mm 1h 1 10 C 360 nm 1,0 ng 10 cm 10,0 ml 500 ml 50 mlISO 6651:2001(F) ISO 2001 Tous droits rservs 5 6 chantillonnage Prlever lchantillon
44、 pour laboratoire sur le produit chantillonner, en se conformant la Norme internationale relative au produit concern, sauf si lchantillonnage en vue de la dtermination de laflatoxine est exclu de son domaine dapplication. Sil nexiste pas de Norme internationale approprie, les parties concernes doive
45、nt se mettre daccord, en tenant compte des caractristiques du produit chantillonner. 7 Mode opratoire 7.1 Prparation de lchantillon pour essai 7.1.1 Si lchantillon contient plus de de matires grasses, il doit tre dgraiss lther de ptrole avant deffectuer le broyage. Les rsultats devront alors tre rap
46、ports la masse dchantillon non dgraiss. 7.1.2 Broyer lchantillon pour laboratoire, de faon quil passe en totalit au travers du tamis (5.2). Bien homogniser. Voir lISO 6498. 7.2 Prise dessai Peser, prs, de lchantillon pour essai dans la fiole conique (5.13). 7.3 Extraction Ajouter la prise dessai (7.
47、2) de terre de diatomes (4.9), puis deau et de chloroforme (4.1) mesurs avec soin laide dune prouvette. Boucher la fiole, secouer ou agiter durant laide de lappareil (5.3). Filtrer sur papier-filtre (5.11) en ayant soin dliminer les 10 premiers millilitres de filtrat et de recueillir une quantit de filtrat suprieure . 7.4 Purification 7.4.1 Prparation de la colonne Remplir les deux tiers du tube pour chromatographie (5.4) avec du chloroforme (4.1) et aj
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