1、z Y Norme internationale INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDlZATION.MEIKAYHAPOAHAR OPrAHM3AL b) par comparaison des rsultats obtenus pour des orga- nismes spcifiques, sur un milieu slectif des membranes fil- trantes, laide des mthodes par talement en surface ou par incorporation en glose, et de
2、ceux obtenus laide de la mthode par filtration sur membrane sur le mme milieu. NOTE - II se peut que la mthode par incorporation en giose four- nisse moins de colonies que la mthode par talement en surface. 5 Diluants, milieux de culture et ractifs 5.1 Composants de base Pour amliorer la reproductib
3、ilit des rsultats, il est recom- mand dutiliser, pour la prparation des diluants et des milieux de culture, des composants de base dshydrats ou des milieux complets dshydrats. Les prescriptions du fabricant doivent tre suivies scrupuleusement. Les produits chimiques utiliss pour la prparation des mi
4、lieux de culture et des ractifs doivent tre de qualit analytique reconnue. Leau utilise doit tre de leau distille ou dminralise, exempte de substances susceptibles dinhiber la croissance des micro-organismes dans les conditions de lessai. ISO 77044985 (F) Les mesurages du pH doivent tre effectus au
5、pH-mtre, les mesures tant rapportes la temprature ambiante. 6.1 Units de filtration sous vide pour membranes fil- trantes, munies dune fiole filtrer sous vide, de tubes et dun flacon destin retenir lhumidit. Si les milieux de culture prpars ne sont pas utiliss extem- poranment, ils doivent, sauf spc
6、ification contraire, tre con- servs lobscurit 4 + 2 OC pendant 1 mois au maximum, dans des conditions vitant toute modification de leur composi- tien. 6.2 Agitateur Vortex ou quipe mlanger les chantillons (facultatif). ment semblable, pour 6.3 Pinces mors plats (sans griffes). 5.2 Diluant 6.4 Incuba
7、teur, bain deau ou cuve chauffante, rglables diverses tempratures. Tout diluant strile appropri peut tre utilis. Lemploi deau peptone 0,l % (mlm) est recommand pour la filtration sur membranes afin de rduire au minimum leffet de choc que pourrait produire le contact de leau pure sur les micro- organ
8、ismes. Lincubateur appropri doit tre frquemment contrl afin de sassurer que la temprature dsire y rgne bien pendant au moins 24 h. Pour cela, un thermomtre dont la prcision a pralablement t vrifie doit tre plac lintrieur de Iincu- bateur, sur la tablette o seront places les botes. 6.5 Compteur de ap
9、propris. colonies, grossissement et clairage 5.3 Milieu glos 5.3.1 Milieu non slectif 66 . Compteur manuel de colonies. La gl ose tryptone soja ou tout autre milieu utilis dans le prsent essai. semblable peut tre 67 . Autoclave ou autre quipement de strilisation. Prparer le milieu et verser une quan
10、tit dtermine de milieu soit dans des botes de Petri (dans le cas de numrations sur membranes filtrantes et de numrations par les techniques dtalement en surface), soit dans des tubes appropris (dans le cas dincorporation en glose). La couche de glose dans les botes de Petri doit tre dau moins 3 mm.
11、Tous les milieux utili- ss pour chaque essai doivent tre prpars partir du mme lot et en mme temps. 68 . verre. Table rotative (facultative) et tige dtalem ent en 6.9 Botes de Petri de taille approprie. striles, munies dun couvercle perc 6.10 Pipettes jauges striles, de OJ; 1,O et 10 ml de capa- cits
12、 5.3.2 Milieu slectif 7 Prparation des chantillons Les milieux utiliss doivent cultures, mixtes ou pures. convenir aux organismes utiliss , en 7.1 Quil sagisse deau naturelle, dchantillons deau de sur- face ou de cultures pures dilues pour valuer les membranes filtrantes, il y aura lieu de procder
13、une analyse avant lessai, afin dobtenir la dilution utiliser (9.2.1). tous les stades, bien mlanger (6.2) les chantillons ou les cultures afin dobtenir une rpartition homogne. Prparer le milieu et verser une quantit dtermine de milieu soit dans des botes de Petri (dans le cas de numrations sur membr
14、anes filtrantes et de numrations par les techniques dtalement en surface), soit dans des tubes appropris (dans le cas dincorporation en glose). La couche de glose dans les botes de Petri doit tre dau moins 3 mm. Tous les milieux utili- ss pour chaque essai doivent tre prpars partir du mme lot et en
15、mme temps. 7.2 Si lon utilise des cultures pures en tat de stress ou non, tablir la concentration des organismes dessai sur un milieu appropri afin de sassurer que lon utilise bien le bon facteur de dilution pour obtenir la gamme de numrations approprie (9.2.1). 6 Appareillage et verrerie 7.3 Les ch
16、antillons utiliss pour tablir les dilutions appro- pries et les gammes de numrations adquates peuvent servir au cours de lessai dfinitif sils sont rfrigrs immdiatement aprs lessai et sils ne sont pas conservs trop longtemps (pas plus de 48 h). Bien mlanger les chantillons afin de les homo- gniser au
17、 maximum. Nettoyer soigneusement toute la verrerie et lquipement de fil- tration, en utilisant un dtergent appropri dans de leau chaude; rincer leau chaude puis avec de leau distille. Suivre les pratiques de laboratoire de microbiologie normalises pour prparer la verrerie et lquipement de filtration
18、 avant de les placer dans lautoclave. Striliser (voir 6.7) 121 OC pen- dant 20 min par chaleur humide, ou 170 OC pendant au moins 60 min par chaleur sche. 8 Membranes filtrantes Matriel courant de laboratoire de microbiologie, et Les membranes filtrantes doivent tre striles. 2 ISO 77044985 (F) 9 Mod
19、e opratoire 91 . Ensemencement et incubation Avant deffectuer lessai, faire scher, dans des conditions aseptiques, les botes de Petri (6.9) contenant la glose nutri- tive non slective (5.3.1) ou la glose slective (5.3.2) vis-vis des organismes dessai, en utilisant lune des mthodes suivan- tes. a) Co
20、uvrir les botes de Petri et les entreposer en position renverse lobscurit (si le milieu est sensible la lumire) et une temprature de 25 30 OC pendant 15 17 h. b) Couvrir les botes de Petri et les entreposer en position renverse lobscurit et une temprature de 45 50 OC pendant 2 3 h. c) Aprs avoir enl
21、ev les couvercles, placer les botes de Petri dans une hotte flux laminaire dair filtr, la tempra- ture de la pice, pendant 1 h. Si lon choisit cette mthode, utiliser des dispositifs de vrification de la strilit. Les chantillons (voir chapitre 7) doivent tre disposition immdiate afin deffectuer les e
22、ssais sans dlai. Utiliser le mme chantillon pour ensemencer les diffrents milieux. Des volu- mes gaux, compris entre 0,l et 0,5 ml dune dilution appro- prie de la culture, doivent tre utiliss pour lensemencement des botes tmoins ou pour la filtration sur membranes. Le volume de 0,5 ml ne doit pas tr
23、e dpass en raison des exigen- ces de la mthode dtalement en surface. Afin dviter tout biais des rsultats, les essais tmoins par ta- lement en surface doivent tre effectus en alternance avec lessai sur membrane filtrante, en utilisant les mmes milieux nutritifs ou slectifs que pour lessai sur membran
24、e filtrante. Si lon compare plus dune sorte de membranes filtrantes, celles-ci doivent tre intercales avec les essais tmoins par ta- lement en surface ou par incorporation en glose jusqu lobtention du nombre requis de doubles partir de Ichantil- Ion spcifique. Les milieux avec et sans membrane filtr
25、ante sont incubs aprs ensemencement dans des conditions de temprature et de dure appropries aux organismes dessai. 9.1.1 Mthode par filtration sur membrane 9.1.1.1 laide des pinces striles (6.31, prendre de facon , aseptique une membrane filtrante (chapitre 8) essayer et la centrer, le ct quadrill v
26、ers le haut, sur la base du support du filtre. Placer lentonnoir filtrant dans le montage et immobiliser laide du support prvu cette fin. Relier la fiole filtrer et la valve vide une pompe vide (voir 6.1). 9.1.1.2 En labsence de vide, ajouter de 20 30 ml de diluant strile (5.2). De facon aseptique,
27、transfrer (voir 6.101, dans leau de dilution de lentonnoir, le mme volume de la dilution dchantillon homognis que celui utilis pour la mthode par talement en surface (9.1 .l .l). Faire le vide et filtrer entire- ment le contenu. Toujours sous vide, rincer deux fois Ienton- noir, avec 20 30 ml deau d
28、e dilution strile. Arrter la pompe vide ds que leau du dernier rincage est passe travers le fil- tre. Enlever lentonnoir filtrant puis, au moyen de pinces stri- les, la membrane filtrante de la base. 9.1.1.3 Placer la membrane examine soit sur le milieu non slectif (5.3.1), soit sur le milieu slecti
29、f (5.3.21, selon lordre de rotation. Drouler la membrane filtrante sur la surface glose de la bote de Petri, en sassurant quil ny a pas dair empri- sonn entre la membrane et la surface de glose. Si lon remar- que la prsence dune bulle dair, soulever la membrane afin dliminer lair et la dposer de nou
30、veau sur la glose. 9.1.1.4 Toutes les botes doivent tre incubes (voir 6.4) la temprature et pendant la dure appropries la nature des organismes utiliss pour lessai. 9.1.2 Mthode par talement en surface 9.1.2.1 De facon aseptique, transfrer (voir 6.10) et taler laide de la tige dtalement en verre (6.
31、8) pralablement trem- pe dans de lalcool et passe la flamme 0,l 0,5 ml de la dilution approprie de lchantillon sur la surface prsche du milieu glos nutritif non slectif ou du milieu glos slectif des membranes filtrantes. Une table rotative peut tre utilise pour taler Iinoculum uniformment sur la sur
32、face de la pla- que. Remettre les couvercles des botes de Petri et laisser les parties aliquotes dchantillon sabsorber compltement avant de renverser les botes. 9.1.2.2 Toutes les botes doivent tre incubes (voir 6.4) ds que possible aprs absorption de lhumidit, la temprature et pendant la dure appro
33、pries la nature des organismes utiliss pour lessai. 9.1.3 Mthode par incorporation en glose 9.1.3.1 De facon aseptique, transfrer (voir 6.10) le mme , volume de la dilution dchantillon homognis que celui uti- lis pour la mthode par talement en surface (9.1.2.1) au fond dune bote de Petri strile (6.9
34、). Ajouter une quantit donne de glose fondue (45 OC), soit de la glose nutritive non slec- tive (5.3.1), soit de la glose slective (5.3.2) des membranes filtrantes, et mlanger soigneusement les deux solutions par des mouvements de va-et-vient et circulaires. 9.1.3.2 Laisser la glose se solidifier co
35、mpltement, puis ren- verser la bote de Petri et incuber (voir 6.4) pendant la dure et la temprature requises. 9.1.3.3 Afin dassurer le contrle de strilit de la glose, ta- ler plusieurs tubes de glose fondue dans des botes. 9.2 Interprtation 9.2.1 Numration des sur membrane) colonies (mthode par filtration Utiliser le compteur de colonies (6.5) pour la numration, la surface de la membrane, de toutes les colonies typiques (prove- nant dchantillons mixtes ou de cultures pures). Si lon a utilis plus dune dilution dun chantillon pour lessai, la dilution choi- 3
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