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DB22 T 2911-2018 贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法.pdf

1、 ICS 67.120.30 B 50 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 29112018 贝类中副溶血性弧菌检测 微滴数字 PCR 法 Determination of Vibrio Parahemolyticus in shellfish-droplet digital PCR method 2018 - 11 - 12 发布 2018 - 12 - 30 实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 2911 2018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/ T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由长春海关(原吉林出入境检验检疫局提出并归口)。

2、本标准起草单位:长春海关(原吉林出入境检验检疫局验检疫技术中心)、吉林大学中日联谊医院、 吉林农业大学。 本标准主要起草人:聂丹丹、聂海英、王宁宁、杜佳剑、曲辉、彭勃、王玮琳、刘金华、罗雁非、 洪晓坤。 DB22/T 2911 2018 1 贝类中副溶血性弧菌检测 微滴数字 PCR 法 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施,并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR 法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步 骤和试验数据处理与防止污染措施。 本标准适用于贝类

3、中副溶血性弧菌检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 4789.1-2016 食品安全国家标准 食品卫生微生物检验 总则 GB 4789.7-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 3 原理 微

4、滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割,根据副溶血性弧菌的 旋转酶 ( gyrase) 特异性基因序列对贝类中副溶血性弧菌进行鉴定。经PCR扩增后,根据泊松分布原理及阳性 微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度,实现对副溶血性弧菌的快速定性检测。 4 试剂和材料 除另有规定外,所有试剂均为分析纯。实验用水符合 GB/T 668 中二级水的要求。 4.1 裂解液,成分包括:2% CTAB(cety ltrithylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),100 mmol/L Tris(tris hydroxymethyl aminomethane,

5、三羟甲基氨基甲烷),1.4 mol/L NaCl, 20 mmol/L EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸),用 HCl 调至 pH8.0。 4.2 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1,v/v/v)。 4.3 氯仿。 4.4 异戊醇。 4.5 无水乙醇。 4.6 异丙醇。 DB22/T 2911 2018 2 4.7 70%乙醇。 4.8 2dd PCR 预混液。 4.9 副溶血性弧菌旋转酶(gyrase)基因引物和探针 4.10 上游引物:5- CGGTAGTAAACC CACTGTCAG -3 下游引物:5 -GTTTCAGGCT CAC

6、CATGACG -3 探针:5-(FAM)- ATCCA TCGTGGCGGTCATATCCAC -(TAMRA)-3 4.11 菌株:副溶血性弧菌阳性标准菌株。 5 仪器和设备 5.1 微量移液器:0.1 L2.5 L,1 L10 L,2 L20 L,10 L100 L,20 L 200 L,100 L1 000 L。 5.2 高速冷冻离心机(12 000 r/min)。 5.3 涡旋混合器。 5.4 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 5.5 微滴生成仪。 5.6 PCR 仪。 5.7 微滴读数系统。 6 样品 6.1 样品的采集按照 GB 4789.1-2016 中 3.1 的规定实施。

7、6.2 样品前处理按照 GB 4789.7-2013 的规定执行。 7 试验步骤 7.1 增菌培养 按照 GB 4789.7 -2013 的规定执行。 7.2 样品 DNA 提取 7.2.1 用移液器(5.1)吸取副溶血性弧菌增菌液 1 mL,加到 1.5 mL 无菌离心管中,12 000 r/min 离心(5.2)10 min,吸弃上清;加入 50 L DNA 裂解液(4.1),混匀(5.3)后沸水浴 5 min,12 000 r/min 离心 5 min。取上清保存于 - 20 备用。 7.2.2 按照 GB/T 19495.3 的规定进行 CTAB 提取法制备模板 DN A(4.1,4.

8、2,4.3,4 .4,4.5,4.6,4.7), 或使用商业化的 DNA 提取试剂盒时按照其说明书操作。 7.3 DNA 浓度和纯度的测定 按照 GB/T 19495.3 的规定,用核酸蛋白分析仪 或紫外分光光度计(5.4)260 nm和280 nm的测定 核酸含量,用双蒸水稀释至1 ng/ L100 ng/ L备用。 7.4 微滴数字 PCR 反应体系 反应体系见表1。 DB22/T 2911 2018 3 表1 微滴数字 PCR 反应体系 试剂成分 体积 L 2dd PCR 预混液(4.8) 10 上游引物( 10 mol/L)(4.9) 1 下游引物 (10 mol/L)(4.9) 1

9、探针 (10 mol/L)(4.9) 1 模板 DNA( 1 ng/L 100 ng/L) 5 双蒸水 2 注1: 空白对照实验时,用双蒸水替代样品DNA。 注2: 阴性对照实验时,用非目标源性成分替代样品DNA。 注3: 阳性对照实验时(4.10),用副溶血性弧菌阳性成分DNA。 7.5 微滴生成 利用微滴生成仪完成 20 L 反应体系的分割(5.5)。 7.6 PCR 反应 反应条件:95 5 min,1个循环;95 15 s,60 1 min,40个循环;98 /10 min(1 /s),12 保存反应产物。体系完成后,进行数字PCR反应。 7.7 微滴读数 PCR反应完成后,选择FAM

10、单荧光通道利用微滴读数系统(5.7)进行微滴读数。数字PCR反应的有效 分割体系数不得低于理论分割体系数的 50%。 8 试验数据处理 8.1 阈值限的设定 8.1.1 阈值限应对空白和阳性扩增结果进行区分。 8.1.2 按照数字 PCR 体系中阴性分割体系的终点荧光值设定。 8.2 质控标准 8.2.1 阳性对照为副溶血性弧菌阳性基因有明显扩增,扩增终点荧光信号大于或等于阈值。 8.2.2 阴性对照为副溶血性弧菌基因无扩增,扩增终点荧光信号小于阈值。 8.2.3 空白对照为副溶血性弧菌基因无扩增,扩增终点荧光信号小于阈值。 8.2.4 与以上实验结果不符,需要重复验证实验步骤。 8.3 结果判定与报告 8.3.1 样品扩增终点荧光信号小于阈值,判为阴性,报告未检出副溶血性弧菌。 8.3.2 样品扩增终点荧光信号大于或等于阈值,判为阳性,报告检出副溶血性弧菌。 9 防止污染措施 DB22/T 2911 2018 4 按照 GB 19489 和 WS/T 2 30-2002 中 6 的规定执行。 _

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