DB32 T 3762.4-2020 新型冠状病毒检测技术规范 第4部分：重组酶介导等温扩增程序.pdf

1、ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.4 2020 新型冠状病毒检测技术规范 第 4 部分 ： 重组酶介导等温扩增程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 4: Recombinase aided amplification test procedure 2020 - 03 - 02 发布 2020 - 03 - 03 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3762.4 2020 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3

2、 术语和定义 . 1 4 环境与设施 . 2 5 设备与耗材 . 2 6 试剂与材料 . 2 7 样本前处理与核酸提取 . 2 8 扩增体系配制与扩增 . 2 9 结果判定 . 3 DB32/T 3762.4 2020 II 前 言 DB32/T 3762新型冠状病毒检测技术规范 目前分为以下部分 ： 第 1部分：生物样本采集、运输和保存 ； 第 2部分：病毒分离与鉴定； 第 3部分：核酸荧光 PCR检测程序； 第 4部分：重组酶介导等温扩增程序； 第 5部分：血清 IgM和 IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； 第 6部分：血清 IgM和 IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； 第 7部分：空气样

3、本 检测与评估； 第 8部分： 物体表面检测与评估 ； 第 9部分：医务人员职业暴露检测与评估。 本部分为 DB32/T 3762 的第 4部分。 本 部分按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本部分由江苏省卫生健康委员会提出。 本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附二院、 昆山市疾病预防控制中心。 本 部分 主要起草人： 朱小娟、 朱宝立、 崔仑标、 葛以跃、程军平、徐佳南、钱志远、罗晓明、沈欢 喜。 DB32/T 3762.4 2020 1 新型冠状病毒检测技术规范 第 4 部分 ： 重组酶

4、介导等温扩增程序 1 范围 本 部分 规定了新型冠状病毒 实验室核酸 重组酶介导等温扩增检测 的 环境与设施、设备与耗材、试剂 与材料、样本前处理与核酸提取、扩增体系配制与扩增、结果判定。 本部分适用于新型冠状病毒实验室核酸重组酶介导等温扩增检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅 注日期的版本适用于本文件。 凡是 不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 医疗机构临床基因扩增管理办法 原 中华人民共和国 卫生部办公厅 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 原 中华人民共和 卫

5、生部检验中心 新型冠状病毒 实验室生物安全指南 中华人民共和 国家卫生健康 委员会 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 等温扩增 isothermal amplification 在等温条件下，短时间内进行核酸扩增的一种基因扩增方法 。 3.2 重组酶介导等温核酸扩增技术 recombinase aided amplification, RAA 一种利用重组酶、单链结合蛋白、 DNA聚合酶在等温条件下（最佳温度 37 ）进行核酸扩增的技 术。 其 原理为：重组酶、单链结合蛋白、引物形成复合体扫描双链 DNA，在与引物同源的序列处使双 链 DNA解旋，单链结合蛋白（ SSB）防止

6、单链 DNA复性，在能量和 dNTP存在的情况下，由 DNA聚合酶 完成链的延伸， 5min 15 min就可实现仪器扩增。 3.3 逆转录 reverse transcription, RT 由一条 RNA单链转录为互补 DNA，由依赖 RNA的 DNA聚合酶（逆转录酶）来完成 ，或称反转录 。 4 环境与 设施 同 本标准 第 3部分 4.1和 4.2。 DB32/T 3762.4 2020 2 5 设备与耗材 5.1 设备 生物安全柜、离心机、 涡旋振荡器、 水浴或 金属浴、 核酸提取仪 、 RAA恒温震荡离心仪 、 RAA恒 温核酸扩增检测仪 。 5.2 耗材 N95及以上防护口罩、

7、医 用无纺布帽 、护目镜、连体防护服、 一次性 PE手套、一次性手术衣 、乳胶 手套、防水靴套、 微量移液器及各种配套带滤芯 Tip头 、 1.5 mL EP管 、 冻存管、冻存盒 。 6 试剂 与 材料 6.1 试剂 核酸提取试剂盒、 RT-RAA核酸扩增试剂盒 。 6.2 材料 消毒剂： 75%乙醇；有效氯 5500mg/L的消毒液（需每天新鲜配制）；生理盐水或磷酸盐缓冲液 （ PH=7.4）； 4%NaOH或含 1g/L蛋白酶 K的磷酸盐缓冲液或 0.1%二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液。 7 样本前处理 与 核酸提取 同 本标准 第 3部分 7.1和 7.2。 8 扩增体系配制 与 扩增 8.

8、1 RT-RAA 核酸扩增试剂盒在室温融化后，瞬时离心，按 n+1 配置反应体系（ n=样本数 +1 管阳性 对照 +1 管阴性对照），每个反应体系配置如下： 表 1 重组酶介导等温扩增反应体系 组成 体积（ L） 灭菌水 12.7 缓冲液 25 上游引物（ 10 M） 2.1 下游引物（ 10 M） 2.1 探针（ 10 M） 0.6 8.2 上述体系配置完成后用手指轻弹混匀，短暂离心。向反应单元中加入 42.5 L 上述混合液，盖 紧管盖，用手指轻弹混匀，短暂离心。 8.3 打开反应单元管，管 盖 内侧加入 2.5 L 乙酸镁。 8.4 向反应单元管中依 次加入 5 L 阴性对照、模板核酸

9、、阳性对照，盖紧管盖。 8.5 将反应管移至 RAA 恒温震荡离心仪 中，长按震荡键， 39 预处理 7 min。 8.6 上述程序结束后， 把 反应管立即移到 RAA 恒温核酸扩增检测仪 中，点击运行键， 39 运行 30 min。 DB32/T 3762.4 2020 3 9 结果判定 9.1 阳性判断 9.1.1 反应结束后，设置斜率为 20，仪器将自动进行数据分析，自动呈现判定结果； 9.1.2 10 min 内，扩增曲线的斜率 20时判断为新型冠状病毒核酸阳性；否则判断为阴性。 9.2 结果分析 9.2.1 阳性质控品为阳性；阴性质控品为阴性 。 9.2.2 如检测结果不符合 9.2.1 的要求，该实验视为无效，应检查 仪器、试剂等的偏差，确认无误后重 新检测 。 _