DB52 T 1308-2018 烟草及烟草制品 绿原酸、莨菪亭、芸香苷、新绿原酸、4-O-咖啡酰奎尼酸、莰菲醇基芸香苷的测定 超高效液相色谱法.pdf

1、 ICS 71.040 B 35 DB52 贵州省地方标准 DB52/T 13082018 烟草及烟草制品 绿原酸、莨菪亭、芸香苷、新绿原酸、4-O- 咖啡酰奎尼酸、莰菲醇基芸香苷的测定 超高效液相色谱法 Tobacco and tobacco products Determination of chlorogenic acid,Scopolamine,rutin,neochlorogenic acid,4-O-Caffeoylquinic acid,Kaempferol 3-O-rutinoside Ultra-High Pressure Liquid Chromatography 2018

2、 - 08 - 13 发布 2019 - 02 - 13 实施 贵州省质量技术监督局 发布 DB52/T 13082018 I 目 次 前 言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 原理 . . 1 4 试剂 . . 1 5 仪器及材料 . . 2 6 样品制备 . . 2 7 分析步骤 . . 2 8 精密度和回收率 . . 3 9 检验报告 . . 4 附录 A（资料性附录） 多酚类化合物标准物质和样品的色谱示例图 . 5 DB52/T 13082018 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则

3、起草。 请注意：本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中国烟草总公司贵州省公司提出并归口。 本标准起草单位：中国烟草总公司贵州省公司、贵州省烟草科学研究院、贵州省标准化院。 本标准主要起草人：耿召良、张婕、洪潇、杨慧、蔡斌、夏范讲、刘文霖、丁根胜、巴金莎、陈兴 江、赵瑞娟、许冬青、王小庭、张继胜。 DB52/T 13082018 1 烟草及烟草制品 绿原酸、莨菪亭、芸香苷、新绿原酸、4-0-咖啡酰 奎尼酸、莰菲醇基芸香苷的测定 超高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了烟草和烟草制品中多酚类化合物（绿原酸、莨菪亭、芸香苷、新绿原酸、4-O-咖啡酰 奎尼

4、酸、莰菲醇基芸香苷）的液相色谱测定方法。 本标准适用于烟草和烟草制品。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 YC/T 31-1996 烟草及烟草制品 试样的制备和水分测定 烘箱法 3 原理 采用40%的甲醇水溶液(v/v)提取烟草或烟草制品中多酚类化合物， 提取液直接进行超高效液相色谱 分析，采用紫外检测器检测，外标法定量。 4 试剂 4.1 基本要求 除特殊要求外，均应使用分析纯试剂。 4

5、.2 试剂种类 4.2.1 绿原酸，含量99%（质量分数）。 4.2.2 莨菪亭，含量99%（质量分数）。 4.2.3 芸香苷，含量97%（质量分数）。 4.2.4 新绿原酸，含量97%（质量分数）。 4.2.5 4-O-咖啡酰奎尼酸，含量 97%（质量分数）。 4.2.6 莰菲醇基芸香苷，含量97%（质量分数）。 4.2.7 甲醇，色谱纯。 4.2.8 冰醋酸，色谱纯。 4.2.9 萃取溶液：40%甲醇水溶液(v/v)。 4.2.10 尼龙针式滤头（0.22 m）。 DB52/T 13082018 2 4.2.11 标准溶液 4.2.11.1 多酚标准储备液 分别称取绿原酸(4.2.1)约1

6、28 mg， 莨菪亭(4.2.2) 约2 mg， 芸香苷(4.2.3)约58 mg， 新绿原酸(4.2.4) 约50 mg、4-O-咖啡酰奎尼酸(4.2.5)约50 mg，莰菲醇基芸香苷(4.2.6)约5 mg，于50 mL烧杯中，用约15 mL 甲醇（4.2.7）溶解，再转移至50 mL容量瓶中用40%的甲醇水溶液（4.2.9）定容至刻度，作为绿原酸、 莨菪亭、芸香苷、新绿原酸、4-O-咖啡酰奎尼酸、莰菲醇基芸香苷的一级混合标准溶液。冷藏于4 保 存，有效期3个月。取用时，放置于常温下，达到常温后方可使用。 4.2.11.2 多酚系列标准溶液配制 取一级混合标准溶液1.0 mL于10 mL容

7、量瓶中，用40%的甲醇水溶液定容至刻度，为多酚的二级标准 溶。分别取二级标准溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL，一级标准溶液0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL于7个 10 mL容量瓶中，用40%的甲醇水溶液配置各级多酚系列标准溶液。 4.2.11.3 流动相 流动相A：0.5%冰醋酸/水(v/v)；流动相B：0.5%冰醋酸/甲醇(v/v)。 5 仪器及材料 5.1 旋风式样品磨，40 目筛。 5.2 分析天平，感量为 0.1 mg。 5.3 超声波振荡器。 5.4 超高效液相色谱仪，配置紫外光检测器。 5.5 色谱柱：亚乙基桥杂化颗粒 C 18柱；规格：1.7 m

8、，2.1 mm100 mm。 6 样品制备 按照YC/T 31-1996执行制备烟草样品并测定水分含量。 7 分析步骤 7.1 样品处理 准确称取过40目筛的100 mg样品置于50 mL离心管中，准确加入20 mL萃取溶液（4.2.9）置于超声波 振动器中，在超声波频率40 KHz，萃取功率130 W条件下超声萃取20 min，取2.0 mL萃取液，用0.22 m微 孔滤膜（4.2.10）过滤后待分析。 7.2 色谱分析 流速：0.25 mL/min； 柱温：30 ； 进样量为 1 L； 运行时间 10 min； 流动相条件：梯度洗脱条件见表 1； DB52/T 13082018 3 表1

9、梯度洗脱条件表 时间/min A/% B/% 0 89 11 0.3 73 27 0.9 67 33 2.0 55 45 4.0 55 45 4.1 20 80 5.4 20 80 5.5 89 11 紫外检测波长：0 min：325 nm；5 min：348 nm。 7.3 标准工作曲线 用多酚标准系列溶液（4.2.11.2）制作标准工作曲线。根据多酚类物质标准溶液的浓度及其响应峰 面积，建立标准工作曲线，工作曲线线性相关系数应不小于0.999。 7.4 样品测定 按照色谱分析条件(7.2)测定样品（7.1）中的多酚类物质，根据保留时间定性，峰面积定量。每个 样品平行测定两次。混合标准溶液和

10、样品溶液色谱图参见附录A。 7.5 结果的计算与表述 样品中的多酚类物质含量按照公式（1）进行计算。 1000)1( Wm Vc X . (1) 式中： X 每克试样中的多酚含量，单位为 mg/g； c 测试样品溶液中多酚质量浓度，单位为微克/毫升（g/mL）； V 萃取溶液的体积，单位为毫升（mL）； m 试样质量，单位为克（g）； W 试样含水率，%； 注：取两次平行测定值的平均值作为样品的测定结果，两次平行测定值之差除以平均值不应大于5%，结果精确至 0.01 mg/g。 8 精密度和回收率 本方法的精密度测定结果和回收率见表2。 DB52/T 13082018 4 表2 方法的回收率、

11、精密度、检出限和定量限结果 成分 样品含/mg/g 标加量/mg/g 测定值/ mg/g 回收率/% 相对标准 偏差/% 检测限 （ g/g） 定量限 （ g/g） 新绿原酸 2.67 2.64 5.38 102.7 1.6 0.024 0.075 绿原酸 10.98 10.10 20.60 95.2 1.2 0.025 0.080 4-O-咖啡酰奎尼 酸 3.66 3.92 7.88 107.6 1.4 0.025 0.082 莨菪亭 0.23 0.20 0.43 99.2 0.5 0.0061 0.020 芸香甘 11.06 10.98 22.78 106.7 0.4 0.051 0.17

12、 莰菲醇基芸香苷 0.82 0.81 1.60 95.9 1.0 0.024 0.075 9 检验报告 检验报告应包括以下内容： 识别被测样品需要的所有信息； 参照本标准所使用的试验方法； 检测结果，包括各单次测定结果及其平均值； 与本标准规定的分析步骤的差异； 在检测中观察到的异常现象； 检测日期； 检测人员。 DB52/T 13082018 5 A A 附 录 A （资料性附录） 多酚类化合物标准物质和样品的色谱示例图 多酚类化合物的标准物质 (A)及样品 (B) 的分析色谱图。 AU 0.00 0.08 0.16 0.24 0.32 分钟 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 A 1 2 3 4 5 6 AU 0.00 0.08 0.16 0.24 0.32 分钟 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 B 1 2 3 4 5 6 1新绿原酸2.42 min；2绿原酸2.88 min；34- O-咖啡酰奎尼酸2.97 min；4莨菪亭3.80 min ； 5芸香苷4.35 min；6莰菲醇基芸香苷5.11 min。 _ DB52/T 1308-2018