GA T 1605-2019 法庭科学 生物检材中丁丙诺啡检验 液相色谱-质谱法.pdf

1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检 材 中丁丙诺啡 检验 液相色谱 -质谱 法 Forensic sciences Examination methods for buprenorphine in biological samples LC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本 标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分

2、析分技术委员 会 (SAC/TC 179/SC1)提 出并归口。 本标准起草单位： 公安部物证鉴定中心 、山西医科大学法医学院 。 本标准 主要 起草人： 王瑞花、董颖、栾玉静、 杜鸿雁、 任昕昕、王爱华 、 宋歌、董林沛、 蔚志文 。 GA/T 1 法庭科学 生物检材中丁丙诺啡检 验 液相色谱 -质谱 法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材 （ 血、尿、肝、肾、胃及胃内容等 ） 中丁丙诺啡的液相色谱 -质谱 （ LC-MS） 定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 生物检材中 丁丙诺啡 的定性分析和定量分析 。 其他 可疑 样品 中 丁丙诺啡 的定 性分析和定量分析可参照使用。

3、 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求 ， 对生物检材进行提取、净化及浓缩， 采用 液相 色谱 -质谱法 定性 定量 ，以保留时间 、质谱特征离子碎片峰和离子 丰度 比 作为定性判断依据；以峰面积 为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂 和 材料

4、 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水， 除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试 剂包括： a) 甲醇（色谱纯）； b) 乙腈（色谱纯）； c) 氨水； d) 盐酸； e) 5%氨 水 /乙腈溶液：量取 5mL 氨水，加乙腈稀释至 100 mL； f) 0.1mol/L 盐酸：量取 8.4mL 浓盐酸，加水稀释至 1000mL； g) 5mmol/L 乙酸铵溶液（ pH 值 9.0） ： 称 取 乙酸铵 0.38g， 加水溶解 并 稀释至 1000mL， 用 氨水 调 至 pH 值为 9.0； GA/T 2 h) 5mmol/L 甲酸铵溶液（ pH 值 3.

5、5）：称取甲酸铵 0.32g，加水溶解稀释至 1000mL，用甲酸调 pH 值为 3.5； i) 标准溶液 ： 1） 1.0mg/mL 标准物质溶 液 ： 根据丁丙诺啡标准物质纯度和盐型换算后， 称取适量， 用甲醇 配制 1.0mg/mL 丁丙诺啡标准物质溶液，置于冰 箱中冷藏保存。有效期 6 个月。 或采用 市售标准溶液 ； 2） 10.0g/mL 标准工作 溶 液： 移取 1.0mg/mL 标准物质溶液 0.1mL，用甲醇稀释至 10mL， 混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的标准工作溶 液均由 1.0mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。 注 ： 特殊

6、情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料 包括： a) 固相萃取柱 ： 混合型阳离子交换（ MCX）固相萃取柱或等效固相萃取柱 ， 使用前依次用甲醇、 水活化； b) 一次性注射器； c) 具盖离心管； d) 有机系 微孔滤膜 ： 0.22m。 6 仪 器 和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -质谱仪：配 有 电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆或离子阱质量分析器 ； b) 离心机； c) 振荡器； d) 电子天平 ； e) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 沉淀 蛋白 移取血液等液体检材样品 0.5mL，或称取铰碎的肝脏等

7、固体检材样品 0.5g于具盖离心管中。加入乙 腈 2mL，振荡 10min， 8000r/min离心 20min，取上清液，经有机 系 微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液， 供仪器 分析 。 7.1.1.2 固相萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL 2.0mL，或称取绞碎的肝脏等固体检材样品 1.0g 2.0g于具盖离心 管中，用 4倍体积 0.1mol/L的盐酸稀释，振荡 10min， 8000r/min离心 20min，取上清液转移至已活化好的 MCX固相萃取柱中，控制上清液过柱流速为 0.5mL/min，依次用 0.1mol/L盐酸 1mL、甲醇 1mL、乙腈 1mL 淋洗，抽干弃去淋

8、洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min， 用 1mL 5%的氨水 /甲醇溶液洗脱， GA/T 3 收集洗脱液 置于浓缩器上 45浓缩至干，残留物用甲醇 200L溶解，用 0.22m的有机系微孔滤膜过 滤， 作 为检材样品提取液，供 仪器 分析。 7.1.1.3 质控样品 制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加丁丙诺啡标准物质，作为添加样品（添加样品的浓度为 20ng/mL），与检材样品 平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1

9、 液相色谱 -质谱 （离子阱质量分析器） 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器 和不同样品 实际情况进行调整： a) 色谱柱： XTerra RP18色谱柱 （ 2.1mm150mm， 3.5m） ，或其他等效反相液相色谱柱； 注： XTerra RP18是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等 效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温： 30； c) 流动相 ： 80%乙腈 :20%5mmoL/L 乙酸铵溶液（氨水调节 pH 至 9.0）； d) 流速： 0.2mL/min； e) 进样体积： 10

10、L； f) 离子源：电喷雾电离（ ESI）； g) 扫描方式： 正离子检测 ， 采用二级全扫， 母离子 M+H+=468.3， 定量 子 离子 m/z=414.2； h) 源电压： 4.5kV； i) 加热毛细管温度 ： 280； j) 鞘气（氮气）流量 ： 38arb，辅助气（氮气）流量 ： 5arb； k) 碰撞能 ： 34 。 7.1.2.1.2 液相色谱 -质谱 （三重四级杆质量分析器）条件 以下为参考条件， 可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C18柱， (2.1mm100 mm,1.7m)或其他等效 色谱柱 ； 注：

11、 ACQUITY UPLC BEH C18是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标 准的使 用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相 ： A： 乙腈 ， B： 5mmol/L甲酸铵溶液（ pH值 3.5） ； c) 梯度洗脱 程序：见表 1； 表 1 梯度洗脱条件 时间 min A B - 10% 90% 1.5 90% 10% 2.2 90% 10% 2.5 10% 90% 4.0 10% 90% GA/T 4 d) 柱温： 35； e) 流速： 0.6mL/min； f) 离子源：电喷雾电离（ ESI）；

12、g) 检测方式：正离子； h) 毛细管电压： 3.5kV； i) 源温度： 150； j) 雾化气流速： 800L/h； k) 锥孔气流速： 50L/h； l) 扫描模式：多反应离子监测（ MRM）； m) MS参考条件（ 定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能 量 ） 见表 2。 表 2 MS 参考 条件 检测目标物 定量离子 对 定性离子 对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 丁丙诺啡 468.4 414.2 468.4 396.1 35 35 468.4 414.2 40 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。 7.2 定量

13、分析 7.2.1 样品 提取 移取 血液等液体检材样品 1.0mL 2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g 2.0g两份，按 7.1.1.2进行操作。 另取等量相似基质的空白样品三份，其中两份分别添加丁丙诺啡标准物质作为添加样品（添加样品 中目标物含量应为检材样品中目标物含量的 (10050)%），另一份作为空白样品，与检材样品平行操作， 得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器 条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析 。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作 溶液，按 7.1.2.1 的分析条

14、件每个样品进样分析 2 3 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算 含量 记录各样品 提取液 平行进样 2 3 次 的 目标物 保留时间和 峰面积值，按公式（ 1）计算含量： GA/T 5 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材样品中目标物的含量 ，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（ g/mL）； A 样 检材 样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 添 添加样品中 目标物 添加量，单位为微克（ g）； V 样 检材 样品的定容体 积，单位为毫升（ mL）； A 添 添加样品提取液中 目标物峰面积

15、平均值； M 样 检材 样品的取样量，单位为克（ g）或毫升（ mL）； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升（ mL）。 7.2.3.2 计算相对相差 记录 两 份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（ 2）计算相对相差： %1 0 021 = X XXRD . (3) 式中： RD 相对相差 ， 用 百分比 （ %）表示 ； X1、 X2 两个 检材 样品平行定量测定的含量数值； X 两个 检材 样品平行定量测定含量的平均 值。 8 结果评 价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳 性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2

16、.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的 标准溶液相比，相对偏差不超过表 3 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 本方法 丁丙诺啡 的检出限 和 相关图谱参见附录 A。 表 3 离子 丰度 比 的最大允许 相对 偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相 对偏差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴 性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 方法检出限参见附录 A。 8.2

17、定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按 两 份检材的平均值计算。如果检材样品中 目标物含量的 RD20%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验。 丁丙诺啡的理化性质、毒理作用 参 见附录 B。 GA/T 6 附 录 A （ 资料性附录） 丁丙诺啡 的 检出限和 相关 图谱 丁丙诺啡 相关 谱 图 见图 A.1图 A.3。 本方法丁丙 诺啡的检出限为 10ng/mL（ g）。 5 u g x u e 0 2 # 156 R T : 2 . 5 7 AV: 1 N L : 3 . 4 5 E 6 F: + c E S I F u l l m s2 4 6 8 .

18、0 0 3 4 . 0 0 1 2 5 . 0 0 - 5 0 0 . 0 0 150 200 250 300 350 400 450 500 m / z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 4 1 4 . 2 3 3 9 6 . 2 3 4 6 8 . 3 14 2 6 . 2 2 3 2 6 . 1 9 3 6 8 . 2 8 4 5 0 . 2 6 2 4 3 . 2 0 2 6 7 . 2 3 3 1 2 . 3 22 2 3 . 1 6 3 3 8 . 2 1 1 9 9 . 1 7 1 7 5

19、 . 1 01 5 2 . 0 8 4 8 6 . 9 6 图 A.1 丁丙诺啡的二级质谱图 (离子阱质量分析器 ) R T : 0 . 0 0 - 8 . 5 4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 T i m e ( m i n ) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce R T : 3 . 3 1 R T : 2 . 2 0 R T : 7 . 4 3 R T : 1 . 1 6 R T : 5 . 3 6 R T : 0 . 1 2 R T : 4 . 7 6 R T : 6 . 1 3 R T :

20、6 . 7 0 R T : 8 . 2 7 N L : 3 . 7 4 E 6 T I C F : + c E S I F u l l m s2 4 6 8 . 0 0 3 4 . 0 0 1 2 5 . 0 0 - 5 0 0 . 0 0 M S I C I S x u e t j 3 图 A.2 血添加 100ng/mL 丁丙诺啡液相色谱质谱离子流图 (离子阱质量分析器 ) GA/T 7 10n g b i ao z h u n 18-M ar -201610: 41: 51 T i m e 0 .5 0 1 .0 0 1 .5 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0

21、4 .0 0 4 .5 0 % 0 100 0 .5 0 1 .0 0 1 .5 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 % 0 100 0 .5 0 1 .0 0 1 .5 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 % 0 100 20160318- 2 M RM o f 4 Ch a n n e l s ES+ 4 6 8 .3 9 9 4 1 4 .1 2 (d i n g b i n g n u o f e i ) 1 .0 2 e 5 Are a 1 .3 0 3709 20160318-

22、2 M RM o f 4 Ch a n n e l s ES+ 4 6 8 .3 9 9 3 9 6 .1 7 (d i n g b i n g n u o f e i ) 1 .2 9 e 5 Are a 1 .3 0 4403 20160318- 2 M RM o f 4 Ch a n n e l s ES+ T IC (d i n g b i n g n u o f e i ) 5 .0 0 e 5 Are a 1 .3 0 18222 图 A.3 丁丙诺啡 的 液相色谱 -质谱图 (三重四级 质量分析器 ) GA/T 8 附 录 B （资料性附录） 丁丙诺啡的理化性质及毒理作用 B.1

23、 理化性质 丁丙诺啡的分子式为 C29H41NO4，分子量为 467.7，化学结构 见图 B.1。 图 B.1 丁丙诺啡化学结构 本品一 般由蒂巴因制得，为白色结晶性粉末，熔点 209，盐酸盐熔点 245。 B.2 毒理作用 丁丙诺啡镇痛作用强于哌替啶和吗啡，镇痛活性为吗啡的 25倍，与 受体亲合力强，可置换出结合 于 受体的其他麻醉性镇痛药，从而产生拮抗作用。该药起效慢，持续时间长。口服后 2h血浆浓度达峰 值， 30min 60min出现镇痛作用，针剂可持续 6h 8h，舌下含片可维持 8h 12h，对呼吸有抑制作用。 该药能减慢心率、使血压轻度下降，但对心排血量无明显影响，药物依赖性近似吗啡。丁丙诺啡血 浆蛋 白结合率为 96%，主要在肝脏代谢，大部分经胆 汁和粪便排泄。丁丙诺啡的主要代谢产物是 N-去烃基丁 丙诺啡。 _