HJ 755-2015 水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法.pdf

1、中华人民共和国国家环境保护标准 HJ 7552015 水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法 Water qualityDetermination of total coliforms and fecal coliforms Paper strip method 2015-10-22发布 2015-12-01实施 环 境 保 护 部 发 布 HJ 7552015 i 中华人民共和国环境保护部 公 告 2015年 第62号 为贯彻中华人民共和国环境保护法，保护环境，保障人体健康，规范环境监测工作，现批准水 质 阿特拉津的测定 气相色谱法等八项标准为国家环境保护标准，并予发布。 标准名称、

2、编号如下： 一、水质 阿特拉津的测定 气相色谱法（ HJ 7542015）； 二、水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法（ HJ 7552015）； 三、水质 丁基黄原酸的测定 紫外分光光度法（ HJ 7562015）； 四、水质 铬的测定 火焰原子吸收分光光度法（ HJ 7572015）； 五、水质 卤代乙酸类化合物的测定 气相色谱法（ HJ 7582015）； 六、环境空气 挥发性有机物的测定 罐采样/气相色谱-质谱法（ HJ 7592015）； 七、固体废物 挥发性有机物的测定 顶空-气相色谱法（ HJ 7602015）； 八、固体废物 有机质的测定 灼烧减量法（ HJ 7612

3、015）。 以上标准自 2015 年 12 月 1 日起实施，由中国环境出版社出版，标准内容可在环境保护部网站 （）查询。 特此公告。 环境保护部 2015年10月22日 HJ 7552015 ii HJ 7552015 iii 目 次 前 言.iv 1 适用范围.1 2 术语和定义.1 3 方法原理.1 4 试剂和材料.1 5 仪器和设备.2 6 样品.2 7 分析步骤.3 8 结果计算与表示.5 9 精密度和准确度.5 10 质量保证和质量控制.6 11 废物处理.6 附录A（资料性附录） 结果判定参考图片.7 附录B（资料性附录） 最大可能数（MPN）表.8 HJ 7552015 iv

4、前 言 为贯彻中华人民共和国环境保护法和中华人民共和国水污染防治法，保护环境，保障人体 健康，规范水中总大肠菌群和粪大肠菌群的测定方法，制定本标准。 本标准规定了地表水和废水中总大肠菌群和粪大肠菌群测定的纸片快速法。 本标准为首次发布。 本标准附录A和附录B为资料性附录。 本标准由环境保护部科技标准司组织制订。 本标准主要起草单位：常州市环境监测中心、环境保护部环境标准研究所。 本标准验证单位：上海市环境监测中心、江苏省环境监测中心、浙江省环境监测中心、苏州市环境 监测中心站、南京市环境监测中心站和泰州市环境监测中心站。 本标准环境保护部2015年10月22日批准。 本标准自2015年12月1

5、日起实施。 本标准由环境保护部解释。 HJ 7552015 1 水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法 1 适用范围 本标准规定了测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群的纸片快速法。 本标准适用于地表水、废水中总大肠菌群和粪大肠菌群的快速测定。 本方法的检出限为20 MPN/L。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 总大肠菌群 total coliforms 37培养，24h内能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 2.2 粪大肠菌群 fecal coliforms 44.5培养，24h内能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 2.3

6、最大可能数 most probable number，MPN 微生物检验常用发酵法，又称稀释法，是一种利用统计学原理定量检测微生物浓度的方法。它根据 不同稀释度一定体积样品中被检微生物存在与否的频率，查表求得样品中微生物的浓度，与直接报告菌 落数的平板计数法不同，它最终报告的是样品中最有可能存在的目标微生物浓度，这个以最大可能存在 的浓度，就被称为最大可能数（most probable number，MPN）。 3 方法原理 按 MPN 法，将一定量的水样以无菌操作的方式接种到吸附有适量指示剂（溴甲酚紫和 2,3,5-氯化 三苯基四氮唑即TTC）以及乳糖等营养成分的无菌滤纸上，在特定的温度（3

7、7或44.5）培养24 h， 当细菌生长繁殖时，产酸使pH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色，同时，产气过程相应的脱氢酶 在适宜的pH范围内，催化底物脱氢还原TTC形成红色的不溶性三苯甲臜（TTF），即可在产酸后的黄 色背景下显示出红色斑点（或红晕）。通过上述指示剂的颜色变化就可对是否产酸产气作出判断，从而 确定是否有总大肠菌群或粪大肠菌群存在，再通过查MPN表就可得出相应总大肠菌群或粪大肠菌群的 浓度值。 4 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯化学试剂。 4.1 市售水质总大肠菌群和粪大肠菌群测试纸片：10 ml水样量纸片、1 ml水样量纸片 按以下方法进行质量鉴定，

8、达到要求后方可使用。 HJ 7552015 2 （1）外层铝箔包装袋应密封完好，内包装聚丙烯塑膜袋无破损。 （2）纸片外观应整洁无毛边，无损坏，呈均匀淡黄绿色，加去离子水或蒸馏水后呈紫色，无论加水 与否，应无杂色斑点，无明显变形，表面平整。 纸片不加水 纸片加水 （3）纸片加入相应水样，充分浸润、吸收后，将内包装聚丙烯塑膜袋倒置，袋口应无水滴悬挂。 （4）纸片以去离子水或蒸馏水充分润湿后，其pH值应在7.07.4范围内。 （5）纸片和内包装聚丙烯塑膜袋应无菌，加入相应水量的无菌水，371培养24 h后，纸片应 无微生物生长，其紫色保持不变，且无红斑出现。 （6）按7.4.2中的方法进行总大肠菌

9、群和粪大肠菌群阴性、阳性标准菌株检验，其特性应符合要求。 4.2 无菌水 用新制备的去离子水或蒸馏水，按无菌操作要求，121高压蒸汽灭菌20 min，备用。 4.3 硫代硫酸钠溶液：r（Na2S2O3）=0.10 g/ml。 称取硫代硫酸钠10 g，溶于适量蒸馏水（或去离子水）中，稀释至100 ml，现配。 4.4 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：r（C10H14N2O8Na22H2O）=0.15 g/ml。 称取EDTA-Na2 15 g，溶于适量蒸馏水（或去离子水）中，稀释至100 ml，此溶液保质期为30 d。 5 仪器和设备 5.1 恒温培养箱：371。 5.2 恒温培养箱：

10、44.50.5。 5.3 高压蒸汽灭菌器：121、101.3 kPa。 5.4 冰箱：04。 5.5 移液管：1 ml0.01 ml、10 ml0.1 ml。 5.6 试管：15 mm150 mm。 5.7 采样瓶：250 ml。 注 1：移液管、试管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎，121高压蒸汽灭菌 20 min， 烘干，备用。 6 样品 6.1 样品采集 与其他项目一同采样时，先单独采集微生物样品，采样瓶不得用水样洗涤，按无菌操作的要求采集 水样约200 ml于灭菌的采样瓶中。 HJ 7552015 3 采集江、河、湖、库等地表水样时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶

11、插入水中，距水面1015 cm 处，瓶口朝水流方向，拔玻塞，使水样灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流， 可握住瓶子水平前推。采好水样后，迅速扎上无菌包装纸。 从龙头装置采集样品时，不要选用漏水的龙头，采水前将龙头打开至最大，放水 35 min；然后 将龙头关闭，用火焰灼烧约3 min灭菌，开足龙头，再放水1 min，以充分除去水管中的滞留杂质。采 样时控制水流速度，小心接入瓶内。 采集地表水、废水样品及一定深度的水样时，可使用灭菌过的专用采样装置采样。 在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。 6.2 样品保存 采样后2 h内检测，否则，需10以下冷

12、藏并不得超过6 h。实验室接样后，不能立即开展检测的， 应将样品放入04冰箱并2 h内测定。 6.3 干扰和消除 如果采集的是含有余氯或经过加氯处理的水样，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（4.3） 0.2 ml；如果采集的是重金属离子含量较高的水样，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠 （EDTA-Na2）溶液（4.4）0.6 ml，以消除干扰。加入干扰消除剂的采样瓶121高压蒸汽灭菌20 min， 采样瓶外壁及包扎纸干燥后可用于样品采集。酸性样品，需在分析前按无菌操作要求调节样品的pH值 至7.08.0。 注2：10 mg硫代硫酸钠可保证去除水样中1.5 mg余氯，硫代硫酸钠用量可根据水

13、样实际余氯量调整。 7 分析步骤 以下步骤均在无菌操作的条件下进行。 7.1 接种水样的准备 当每张纸片接种水样量为10 ml或1 ml时，充分混匀水样备用即可。 当每张纸片接种水样量小于1 ml时，水样应制成稀释样品后使用。接种量为0.1 ml、0.01 ml时， 分别制成110稀释样品、1100稀释样品。其他接种量的稀释样品依次类推。 110 稀释样品的制作方法为：吸取 1 ml 水样，注入盛有 9 ml 无菌水的试管中，混匀，制成 1 10稀释样品。其他稀释度的稀释样品同法制作。 7.2 水样接种 7.2.1 接种量 每个样品按三个10倍递减的不同接种量接种，每个接种量分别接种5张纸片，

14、共接种15张纸片。 根据水样的污染程度确定接种量，应尽可能使5个接种量最大的纸片为阳性、5个接种量最小的纸 片为阴性，避免出现所有三个不同接种量共15张纸片全部为阳性或者全部为阴性。 清洁水样的参考接种量分别为 10 ml、1 ml、0.1 ml，受污染水样参考接种量根据污染程度可接种 1 ml、0.1 ml、0.01 ml或0.1 ml、0.01 ml、0.001 ml等，见表1。 7.2.2 接种 清洁水样，接种水样总量为55.5 ml，10 ml水样量纸片5张，每张接种水样10 ml，1 ml水样量纸 片10张，其中5张各接种水样1 ml，另5张各接种110的稀释水样1 ml。受污染水样

15、，接种3个不 同稀释度的1 ml稀释水样各5张。 HJ 7552015 4 表1 水样接种量参考表 接种量/ml 水样类型 10 1 0.1 102 103 104 105 106 湖水、水源水 河水 生活污水 医疗机构排放污水（处理后） 畜禽养殖业等排放废水 接种水样应均匀滴加在纸片上，纸片充分浸润、吸收水样，用手在聚丙烯塑膜袋外侧轻轻抚平，做 好标记。 注3：纸片加入水样后，短时间内变黄或褪色，表明水样存在酸性物质或氧化剂干扰，需按6.3去除。 7.3 培养 检测总大肠菌群时，在371的条件下培养1824 h后观察结果；检测粪大肠菌群时，在 44.50.5的条件下培养1824 h后观察结果

16、。 注4：检测粪大肠菌群时，纸片接种后应立即放置于44.50.5的恒温培养箱中培养，在常温下放置过久将影响 检测结果的准确性。 7.4 对照试验 7.4.1 空白对照 用无菌水做全程序空白测定，培养后的纸片上不得有任何颜色反应，否则，该次样品测定结果无效， 应查明原因后重新测定。 7.4.2 阳性及阴性对照 总大肠菌群测定的阳性菌株为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），阴性菌株为金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）；粪大肠菌群测定的阳性菌株为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），阴性菌株为 产气肠杆菌（Enterobacter aerogen

17、es）。 上述标准菌株均制成浓度为3003 000个/ml的菌悬液，分别取相应水量的菌悬液接种纸片，阳性 与阴性菌株各5张，按7.3要求培养，大肠埃希氏菌应呈现阳性反应；金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌应 呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。 注5：可先制备较高浓度菌悬液，采用血球计数器在显微镜下对其浓度进行初步测定，然后根据实际情况用无菌水 稀释至3003 000个/ml。 7.5 结果判读 （1）纸片上出现红斑或红晕且周围变黄，为阳性。 （2）纸片全片变黄，无红斑或红晕，为阳性。 （3）纸片部分变黄，无红斑或红晕，为阴性。 （4）纸片的紫色背景上出现红斑或红晕，而周围

18、不变黄，为阴性。 （5）纸片无变化，为阴性。 结果判读参照图片见附录A。 HJ 7552015 5 8 结果计算与表示 8.1 结果计算 根据不同接种量的阳性纸片数量，查MPN表（附录B）得到MPN值（MPN/100 ml），按式（1） 换算并报告1 L水样中总大肠菌群或粪大肠菌群数： 100 MC Q= （1） 式中：C水样总大肠菌群或粪大肠菌群浓度，MPN/L； M查MPN表得到的MPN值，MPN/100 ml； Q实际水样最大接种量，ml； 1001010 ml，其中，10将MPN值的单位MPN/100 ml转换为MPN/L，10 ml为MPN表中 最大接种量。 8.2 结果表示 测定结

19、果保留两位有效数字，大于等于 100 时以科学计数法表示，结果的单位为 MPN/L。平均值 以几何平均计算。 9 精密度和准确度 微生物检测数据为偏态分布，按其统计分析要求，其检测结果全部经对数（以10为底）转换后进 行以下分析。 9.1 精密度 6 家实验室分别对有证标准样品（15 600 MPN/L）、低浓度（4.0102 MPN/L）、中浓度（1.0104 MPN/L）、高浓度（8.0104 MPN/L）实际样品的总大肠菌群进行了测定，实验室内的相对标准偏差范围 分别为4.5%7.5%、3.5%12.4%、4.5%6.9%、2.8%5.8%；实验室间的相对标准偏差分别为3.3%、 12.

20、6%、4.6%、1.6%；重复性限分别为0.61、0.67、0.67、0.64；再现性限分别为1.09、0.81、0.66、0.69。 6 家实验室分别对有证标准样品（12 100 MPN/L）、低浓度（1.0102 MPN/L）、中浓度（4.0103 MPN/L）、高浓度（5.0104 MPN/L）实际样品的粪大肠菌群进行了测定，实验室内的相对标准偏差范围 分别为 4.5%11.3%、11.4%31.3%、2.8%21.5%、3.9%13.2%；实验室间的相对标准偏差分别为 5.2%、14.8%、11.9%、8.2%。重复性限分别为 0.93、0.83、0.85、0.77；再现性限分别为 1

21、.28、1.44、 1.35、0.89。 9.2 准确度 6家实验室对总大肠菌群有证标准样品（15 600 MPN/L）进行测定，实验室内相对误差的范围 是5.5%12.8%，相对误差的最终值为8.8%6.0%。 6家实验室对粪大肠菌群有证标准样品（12 100 MPN/L）进行测定，实验室内相对误差的范围 是3.8%16.0%，相对误差的最终值为10.3%9.2%。 HJ 7552015 6 10 质量保证和质量控制 10.1 必须使用质量鉴定合格的纸片。 10.2 每批样品按7.4进行全程序空白测定，并使用有证标准菌株进行阳性、阴性对照试验。 11 废物处理 使用后的器皿及废弃物须经 12

22、1高压蒸汽灭菌 20 min 后，器皿方可清洗，废弃物作为一般废物 处置。 HJ 7552015 7 附 录 A （资料性附录） 结果判定参考图片 阳 性 （纸片上出现红斑或红晕且周围变黄） 阳 性 阴 性 （纸片全片变黄，无红斑或红晕） （纸片无变化） 阴 性 （纸片部分变黄，无红斑或红晕） 阴 性 （纸片的紫色背景上出现红斑或红晕，而周围不变黄） HJ 7552015 8 附 录 B （资料性附录） 最大可能数（MPN）表 （水样接种量为5份10 ml，5份1 ml，5份0.1 ml） 各接种量阳性份数 95%置信限 各接种量阳性份数 95%置信限 10 ml 1 ml 0.1 ml MP

23、N/100 ml 下限 上限 10 ml 1 ml 0.1 ml MPN/100 ml 下限 上限 0 0 0 2 1 0 2 6 0.5 15 0 0 1 2 0.5 7 1 0 3 8 1 19 0 0 2 4 0.5 7 1 0 4 10 0 0 3 5 1 0 5 12 0 0 4 7 1 1 0 4 0.5 11 0 0 5 9 1 1 1 6 0.5 15 0 1 0 2 0.5 7 1 1 2 8 1 19 0 1 1 4 0.5 11 1 1 3 10 0 1 2 6 0.5 15 1 1 4 12 0 1 3 7 1 1 5 14 0 1 4 9 1 2 0 6 0.5 15

24、 0 1 5 11 1 2 1 8 1 19 0 2 0 4 0.5 11 1 2 2 10 2 23 0 2 1 6 0.5 15 1 2 3 12 0 2 2 7 1 2 4 15 0 2 3 9 1 2 5 17 0 2 4 11 1 3 0 8 1 19 0 2 5 13 1 3 1 10 2 23 0 3 0 6 0.5 15 1 3 2 12 0 3 1 7 1 3 3 15 0 3 2 9 1 3 4 17 0 3 3 11 1 3 5 19 0 3 4 13 1 4 0 11 2 25 0 3 5 15 1 4 1 13 0 4 0 8 1 4 2 15 0 4 1 9 1 4

25、 3 17 0 4 2 11 1 4 4 19 0 4 3 13 1 4 5 22 0 4 4 15 1 5 0 13 0 4 5 17 1 5 1 15 0 5 0 9 1 5 2 17 0 5 1 11 1 5 3 19 0 5 2 13 1 5 4 22 0 5 3 15 1 5 5 24 0 5 4 17 2 0 0 5 0.5 13 0 5 5 19 2 0 1 7 1 17 1 0 0 2 0.5 7 2 0 2 9 2 21 1 0 1 4 0.5 11 2 0 3 12 3 28 HJ 7552015 9 续表 各接种量阳性份数 95%置信限 各接种量阳性份数 95%置信限 1

26、0 ml 1 ml 0.1 ml MPN/100 ml 下限 上限 10 ml 1 ml 0.1 ml MPN/100 ml 下限 上限 2 0 4 14 3 2 1 17 5 46 2 0 5 16 3 2 2 20 6 60 2 1 0 7 1 17 3 2 3 24 2 1 1 9 2 21 3 2 4 27 2 1 2 12 3 28 3 2 5 31 2 1 3 14 3 3 0 17 5 46 2 1 4 17 3 3 1 21 7 63 2 1 5 19 3 3 2 24 2 2 0 9 2 21 3 3 3 28 2 2 1 12 3 28 3 3 4 32 2 2 2 14

27、4 34 3 3 5 36 2 2 3 17 3 4 0 21 7 63 2 2 4 19 3 4 1 24 8 72 2 2 5 22 3 4 2 28 2 3 0 12 3 28 3 4 3 32 2 3 1 14 4 34 3 4 4 36 2 3 2 17 3 4 5 40 2 3 3 20 3 5 0 25 8 75 2 3 4 22 3 5 1 29 2 3 5 25 3 5 2 32 2 4 0 15 4 37 3 5 3 37 2 4 1 17 3 5 4 41 2 4 2 20 3 5 5 45 2 4 3 23 4 0 0 13 3 31 2 4 4 25 4 0 1 17

28、 5 46 2 4 5 28 4 0 2 21 7 63 2 5 0 17 4 0 3 25 8 75 2 5 1 20 4 0 4 30 2 5 2 23 4 0 5 36 2 5 3 26 4 1 0 17 5 46 2 5 4 29 4 1 1 21 7 63 2 5 5 32 4 1 2 26 9 78 3 0 0 8 1 19 4 1 3 31 3 0 1 11 2 25 4 1 4 36 3 0 2 13 3 31 4 1 5 42 3 0 3 16 4 2 0 22 7 67 3 0 4 20 4 2 1 26 9 78 3 0 5 23 4 2 2 32 11 91 3 1 0

29、 11 2 25 4 2 3 38 3 1 1 14 4 34 4 2 4 44 3 1 2 17 5 46 4 2 5 50 3 1 3 20 6 60 4 3 0 27 9 80 3 1 4 23 4 3 1 33 11 93 3 1 5 27 4 3 2 39 13 110 3 2 0 14 4 34 4 3 3 45 HJ 7552015 10 续表 各接种量阳性份数 95%置信限 各接种量阳性份数 95%置信限 10 ml 1 ml 0.1 ml MPN/100 ml 下限 上限 10 ml 1 ml 0.1 ml MPN/100 ml 下限 上限 4 3 4 52 5 1 5 13

30、0 4 3 5 59 5 2 0 49 17 130 4 4 0 34 12 93 5 2 1 70 23 170 4 4 1 40 14 110 5 2 2 94 28 220 4 4 2 47 5 2 3 120 33 280 4 4 3 54 5 2 4 150 38 370 4 4 4 62 5 2 5 180 44 520 4 4 5 69 5 3 0 79 25 190 4 5 0 41 16 120 5 3 1 110 31 250 4 5 1 48 5 3 2 140 37 340 4 5 2 56 5 3 3 180 44 500 4 5 3 64 5 3 4 210 53

31、670 4 5 4 72 5 3 5 250 77 790 4 5 5 81 5 4 0 130 35 300 5 0 0 23 7 70 5 4 1 170 43 490 5 0 1 31 11 89 5 4 2 220 57 700 5 0 2 43 15 110 5 4 3 280 90 850 5 0 3 58 19 140 5 4 4 350 120 1 000 5 0 4 76 24 180 5 4 5 430 150 1 200 5 0 5 95 5 5 0 240 68 750 5 1 0 33 11 93 5 5 1 350 120 1 000 5 1 1 46 16 120 5 5 2 540 180 1 400 5 1 2 63 21 150 5 5 3 920 300 3 200 5 1 3 84 26 200 5 5 4 1 600 640 5 800 5 1 4 110 5 5 5 2 400 800