DB3301 T 1089-2018 甘薯脱毒种苗标准化生产技术规程.pdf

1、ICS 65.020.20B 21 DB3301浙 江 省 杭 州 市 地 方 标 准DB 3301/T 10892018甘 薯 脱 毒 种 苗 标 准 化 生 产 技 术 规 程 2018 - 06 - 20 发 布 2018- 06- 20 实 施杭 州 市 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB3301/T 10892018 I 前 言本 标 准 按 照 GB/T 1.1 2009给 出 的 规 则 起 草 。本 标 准 由 杭 州 市 农 业 局 提 出 并 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 杭 州 市 农 业 科 学 研 究 院 、 建 德 市 种 子 管 理 站 、 余

2、杭 区 农 业 技 术 推 广 中 心 、 淳 安 县农 业 技 术 推 广 中 心 、 临 安 区 农 林 技 术 推 广 中 心 、 浙 江 大 学 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 石 江 、 赵 琳 、 严 百 元 、 方 文 英 、 余 建 忠 、 骆 乐 谈 、 朱 月 清 、 孙 钟 毓 、 马 华 升 。 DB3301/T 10892018 1 甘 薯 脱 毒 种 苗 标 准 化 生 产 技 术 规 程1 范 围本 标 准 规 定 了 甘 薯 脱 毒 种 苗 的 术 语 和 定 义 、 生 产 技 术 、 控 制 和 淘 汰 的 病 虫 害 、 病 虫 害 防 治 、 抽

3、样 、扩 繁 苗 的 检 测 、 质 量 要 求 和 收 获 。本 标 准 适 用 于 甘 薯 脱 毒 种 苗 繁 育 、 生 产 和 质 量 管 控 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件 。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 GB 7413 甘 薯 种 苗 产 地 检 疫 规 程NY/T 402 脱 毒 甘 薯 种 薯 (苗 )病

4、 毒 检 测 技 术 规 程NY/T 1200 甘 薯 脱 毒 种 薯3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准 。3.1 脱 毒 组 培 苗应 用 茎 尖 分 生 组 织 培 养 技 术 获 得 ， 经 检 测 确 认 不 带 甘 薯 羽 状 斑 驳 病 毒 （ SPFMV） 、 甘 薯 褪 绿 斑 病 毒（ SPCFV） 、 甘 薯 病 毒 G（ SPVG） 、 甘 薯 病 毒 2（ SPV2） 、 甘 薯 褪 绿 矮 缩 病 毒 （ SPCSV） 的 组 培 苗 。3.2 脱 毒 种 苗 在 有 保 护 措 施 的 基 质 中 用 脱 毒 组 培 苗 扩 繁

5、 后 的 种 苗 ， 在 本 规 范 中 ， 包 括 初 级 至 四 级 繁 育 的 脱 毒 种 苗 。4 生 产 技 术4.1 基 地 选 择应 选 择 周 边 500 m内 无 村 庄 ， 无 甘 薯 及 旋 花 科 、 茄 科 、 葫 芦 科 作 物 种 植 ， 无 检 疫 性 病 虫 害 发 生 的 区域 ， 选 用 背 风 向 阳 、 排 灌 方 便 、 前 作 非 以 上 作 物 种 植 及 有 隔 离 条 件 的 地 块 ， 建 立 塑 料 大 棚 ， 大 棚 外 完 全覆 盖 60目 尼 龙 网 ， 其 中 入 口 处 设 拉 链 ， 方 便 人 员 进 出 。4.2 育 苗

6、基 质根 据 条 件 选 用 商 用 育 苗 基 质 。4.3 基 质 槽 建 立 与 基 质 铺 设 DB3301/T 10892018 2 在 保 护 大 棚 内 ， 按 基 质 槽 宽 80 cm， 操 作 道 宽 40 cm， 建 立 基 质 槽 ， 槽 底 用 约 10 cm细 石 子 与 土 壤 隔离 ， 基 质 铺 设 厚 度 约 20 cm。 移 栽 前 1天 浇 水 至 基 质 含 水 量 70%左 右 。4.4 基 质 消 毒脱 毒 组 培 苗 移 栽 前 40天 ， 密 闭 大 棚 ， 用 二 氧 化 氯 土 壤 消 毒 剂 （ 2 kg/667 m2） 通 过 喷 灌

7、或 滴 灌 对 基质 进 行 消 毒 ， 直 到 基 质 底 层 完 全 湿 润 后 关 闭 阀 门 ， 大 棚 密 闭 消 毒 7天 ， 随 后 通 风 排 除 残 留 氯 气 。4.5 种 性 鉴 定将 脱 毒 苗 种 植 于 防 虫 网 室 内 ， 每 株 系 3株 ， 对 照 原 品 种 的 特 征 特 性 及 生 产 力 鉴 定 ， 剔 除 变 异 株 系 和混 杂 株 系 ， 选 用 生 产 力 强 的 株 系 进 行 扩 大 繁 殖 。4.6 脱 毒 种 苗 繁 育4.6.1 初 级 脱 毒 种 苗 繁 育 大 棚 基 质 槽 加 设 小 拱 棚 ， 当 小 拱 棚 内 温 度

8、稳 定 在 20 以 上 时 ， 选 取 植 株 长 势 好 、 经 鉴 定 无 病 毒 携 带的 脱 毒 组 培 苗 ， 洗 去 根 部 培 养 基 后 即 刻 移 栽 至 大 棚 ， 基 质 槽 内 密 度 为 20 cm20cm。 边 移 栽 边 浇 水 活 苗 ，并 遮 荫 3天 。 注 意 大 棚 、 小 拱 棚 内 通 风 管 理 ， 保 持 苗 生 长 温 度 在 25-30 ， 当 大 棚 内 温 度 稳 定 在 20 以 上时 ， 拆 掉 小 拱 棚 。 根 据 基 质 类 型 、 种 苗 生 长 情 况 对 其 进 行 肥 水 管 理 。4.6.2 次 级 脱 毒 种 苗

9、繁 育当 初 级 脱 毒 种 苗 生 长 至 10节 以 上 ， 以 每 2节 作 1株 剪 取 种 苗 ， 母 株 留 1 2个 节 位 ， 用 作 次 级 脱 毒 种 苗生 产 。 剪 取 的 种 苗 立 即 在 次 级 脱 毒 种 苗 繁 育 大 棚 内 移 栽 ， 在 基 质 槽 内 脱 毒 组 培 苗 移 栽 密 度 约 为 40 cm10cm。 管 理 同 4.6.14.6.3 三 级 脱 毒 种 苗 繁 育当 次 级 脱 毒 种 苗 生 长 总 节 数 至 20节 以 上 时 ， 按 照 4.6.2的 方 法 繁 育 三 级 脱 毒 种 苗 。 4.6.4 四 级 脱 毒 种 苗

10、 繁 育参 照 4.6.3 三 级 脱 毒 种 苗 繁 育 的 方 法 。5 控 制 和 淘 汰 的 病 虫 害5.1 控 制 的 病 虫 害通 过 控 制 病 害 的 发 生 程 度 以 达 到 脱 毒 种 苗 质 量 要 求 的 病 害 :a) 甘 薯 羽 状 斑 驳 病 毒 （ sweet potato feathery mottle virus,SPFMV） ；b) 甘 薯 褪 绿 斑 病 毒 （ sweet potato chlorotic flecks virus,SPCFV） ；c) 甘 薯 病 毒 G（ sweet potato virus G,SPVG） ；d) 甘 薯 病

11、毒 2（ sweet potato virus 2,SPV2） ；e) 甘 薯 褪 绿 矮 缩 病 毒 （ sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV） ； f) 黑 斑 病 （ Black rot， 病 原 Ceratocystis fimbriata ELL. Halst） ；g) 疮 痂 病 （ Scab,病 原 Sphaceloma batatas Sawada） ；h) 蔓 割 病 Stem rot, Fusarium wilt； 病 原 Fusarium oxysporum f.sp.batatas (Wollenweber)Snyderet

12、Hansen； DB3301/T 10892018 3 i) 茎 线 虫 病 （ Stem nematode,Brown ring； 病 原 Ditylenchus destructor Thorne） 。5.2 淘 汰 的 病 虫 害不 能 在 达 到 质 量 要 求 的 脱 毒 种 苗 上 发 生 的 病 虫 害 ：a) 根 结 线 虫 病 Root-knot nematode， 病 原 Meloidogyne incognita(Kofoid White)Chitwood；b) 细 菌 性 萎 蔫 病 （ 甘 薯 瘟 ） （ Bacterial wilt,病 原 Pseudomonas

13、solanacearum E.F.Sm.） ；c) 根 腐 病 Root rot,病 原 Fusarium solani(Mart.)Sacc.f.sp.batatas Mc Clure；d) 甘 薯 小 象 甲 （ 蚁 象 ） Weevil, Cylas.formicarius(Fabricius)；e) 茎 腐 病 （ bacterial stem and root rot； 病 原 Erwinia cA/ysanfAmi） 。6 病 虫 害 防 治6.1 主 要 病 虫 害 主 要 病 虫 害 有 甘 薯 黑 斑 病 、 根 腐 病 、 病 毒 病 、 蚜 虫 、 地 老 虎 、 蛴 螬

14、 等 。6.2 防 治 原 则按 照 “预 防 为 主 ， 综 合 防 治 ”的 方 针 ， 坚 持 以 “农 业 防 治 、 物 理 防 治 和 生 物 防 治 为 主 ， 化 学 防 治 为 辅 ”的 无 害 化 治 理 原 则 。6.3 农 业 防 治保 持 防 虫 网 的 完 整 ， 加 强 操 作 人 员 进 入 卫 生 与 进 出 管 理 ， 及 时 关 闭 防 虫 网 ， 合 理 调 节 环 境 因 子 、 改善 栽 培 条 件 、 优 化 水 肥 管 理 ， 创 造 有 利 于 甘 薯 生 长 发 育 而 不 利 于 病 害 发 生 的 环 境 条 件 。6.4 物 理 防 治

15、采 用 杀 虫 灯 、 黄 板 以 及 性 诱 剂 诱 杀 害 虫 。 6.5 生 物 防 治释 放 天 敌 ， 保 护 天 敌 ， 创 造 有 利 于 天 敌 生 存 的 环 境 ， 选 择 对 天 敌 杀 伤 力 低 的 农 药 。6.6 化 学 防 治6.6.1 防 治 原 则对 症 下 药 ， 适 期 用 药 ， 交 替 使 用 。 运 用 适 当 的 浓 度 与 剂 量 ， 合 理 混 配 ， 严 格 控 制 用 量 。6.6.2 黑 斑 病用 60%唑 醚 代 森 联 1000倍 液 或 25%嘧 菌 酯 1500倍 液 浸 泡 茎 基 部 6 cm 10 cm处 10 min 1

16、2 min， 然 后再 进 行 扦 插 。6.6.3 根 腐 病 用 77%氢 氧 化 铜 可 湿 性 粉 剂 500倍 液 等 喷 雾 防 治 。6.6.4 蚜 虫用 10%啶 虫 脒 3000倍 液 喷 雾 防 治 。 DB3301/T 10892018 4 6.6.5 地 老 虎 和 蛴 螬用 0.2%联 苯 菊 酯 颗 粒 剂 亩 施 3 5kg或 1%联 苯 噻 虫 胺 颗 粒 剂 亩 施 5-6kg， 可 结 合 后 期 施 肥 一 同 施 下 。7 抽 样7.1 脱 毒 组 培 苗 抽 样7.1.1 脱 毒 核 心 材 料 必 须 每 株 都 进 行 检 测 。7.1.2 扩 繁

17、 组 培 苗 随 机 抽 取 1% 2%。7.2 甘 薯 脱 毒 种 苗 抽 样采 收 前 1周 ， 在 目 测 全 田 基 础 上 ， 采 用 五 点 取 样 法 ， 抽 样 数 量 为 ： 1000 m 2以 下 200株 ； 1100 10000hm2 500株 ； 病 毒 检 测 每 株 取 茎 蔓 上 、 中 、 下 部 叶 片 各 1片 ， 应 液 氮 或 干 冰 保 存 ， 一 天 内 检 测 。8 检 测8.1 生 物 学 方 法8.1.1 目 测 法 （ 外 观 症 状 诊 断 法 ） 可 根 据 甘 薯 叶 片 上 出 现 的 典 型 症 状 判 断 甘 薯 是 否 带 毒

18、 。 甘 薯 病 毒病 的 主 要 症 状 详 见 附 录 A。8.1.2 指 示 植 物 检 测 法 用 于 辅 助 检 测 甘 薯 羽 状 斑 驳 病 毒 和 甘 薯 潜 隐 病 毒 。 方 法 ： 以 待 检 样 品 茎 蔓 为接 穗 ， 巴 西 牵 牛 为 砧 木 。 将 待 检 样 品 茎 蔓 中 下 部 茎 段 切 成 3 段 5段 ， 每 个 接 穗 带 一 个 单 芽 及 叶 片 ， 去叶 后 将 底 端 削 成 楔 形 ， 插 入 巴 西 牵 牛 砧 木 切 口 内 ， 封 口 膜 扎 紧 。 巴 西 牵 牛 生 长 出 1 2 片 真 叶 时 嫁 接 ，嫁 接 后 白 天

19、保 持 气 温 26 32 ， 相 对 湿 度 80% 90%， 适 当 遮 荫 ， 嫁 接 成 功 后 ， 给 予 充 足 光 照 。 嫁 接 后 2周 3 周 显 症 ， 在 所 有 嫁 接 指 示 植 物 中 只 要 有 一 株 植 物 叶 片 表 现 羽 状 斑 驳 症 状 即 存 在 羽 状 斑 驳 病 毒 ，叶 脉 变 黄 则 存 在 甘 薯 潜 隐 病 毒 ， 叶 片 褪 绿 斑 则 存 在 甘 薯 褪 绿 斑 病 毒 。8.2 酶 联 免 疫 吸 附 法 （ ELISA）当 组 培 苗 展 开 叶 达 6片 以 上 时 进 行 检 测 ， 检 测 方 法 见 附 录 B。8.3

20、 RT-PCR技 术运 用 RT-PCR技 术 对 提 取 的 甘 薯 叶 片 总 RNA进 行 检 测 。9 质 量 要 求凡 酶 联 免 疫 检 测 、 RT-PCR检 测 或 指 示 植 物 检 测 呈 阳 性 者 为 带 毒 （ 苗 ） ， 其 中 原 种 病 毒 病 株 允 许 率 2.0%， 生 产 用 种 病 毒 病 株 允 许 率 10%。 脱 毒 种 苗 分 级 以 繁 殖 田 播 种 的 种 薯 级 别 、 带 病 植 株 比 率 、 混 杂 植 株 比 率 为 定 级 标 准 。 只 要 检 出 根 腐 病 、 根 结 线 虫 病 、 甘 薯 瘟 、 甘 薯 茎 腐 病

21、、 甘 薯 小 象 甲 （ 蚁 象 ） ， 即不 能 作 为 种 苗 。 具 体 见 附 录 A。10 生 产 用 脱 毒 种 苗 收 获 DB3301/T 10892018 5 次 级 脱 毒 种 苗 及 三 、 四 级 脱 毒 种 苗 均 可 作 为 生 产 用 脱 毒 种 苗 ， 作 生 产 用 脱 毒 种 苗 时 ， 应 剪 取 3 4节 为 1株 苗 。 不 同 品 种 单 收 单 放 ， 做 好 标 记 严 禁 混 杂 。11 生 产 模 式 图生 产 技 术 模 式 见 附 录 C。 DB3301/T 10892018 6 AA附 录 A（ 资 料 性 附 录 ）甘 薯 主 要

22、病 虫 害 症 状甘 薯 主 要 病 虫 害 症 状 参 见 表 A.1。 表 A.1 甘 薯 主 要 病 虫 害 症 状病 害 名 称 植 株 块 根 甘 薯 病 毒 病 苗 期 叶 片 褪 绿 斑 点 或 轻 微 褪 绿 半 透 明 斑 ， 边 缘上 卷 ， 生 长 后 期 ， 有 些 斑 点 四 周 呈 紫 褐 色 或 形 成 紫环 斑 ， 多 数 品 种 沿 叶 脉 形 成 紫 色 羽 纹 状 ； 发 展 到 一定 时 期 ， 叶 片 皱 缩 黄 化 ， 叶 缘 不 整 齐 或 扭 曲 ， 有 与中 脉 平 行 的 褪 绿 半 透 明 斑 ， 个 别 植 株 有 丛 生 现 象 。 薯

23、 块 上 产 生 黑 褐 色 或 黄 褐 色 龟 裂 纹 ， 排 列 成横 带 状 或 贮 藏 后 内 部 薯 肉 木 栓 化 ， 剖 开 病 薯 可 见肉 质 部 具 黄 褐 色 硬 脆 斑 块 。甘 薯 细 菌 性萎 蔫 病 （ 甘 薯瘟 ） 从 育 苗 到 结 薯 均 能 发 病 。 晴 天 中 午 ， 病 苗 顶 部叶 片 萎 垂 ， 茎 基 呈 现 黑 褐 色 水 烂 状 ， 维 管 束 从 上 而下 黄 褐 色 条 纹 状 ， 严 重 时 ， 茎 内 全 部 腐 烂 ， 仅 残 留纤 维 。 成 株 发 病 ， 叶 色 暗 淡 ， 无 光 泽 ， 蔓 出 现 水 渍状 斑 点 ，

24、呈 黑 褐 色 ， 剖 视 维 管 束 ， 褐 色 条 纹 用 手 拉易 脱 皮 ， 留 下 纤 维 。 轻 病 薯 块 乳 汁 明 显 减 少 ， 有 臭 味 ， 煮 后 不 烂 ，外 表 症 状 常 部 明 显 ， 仅 薯 蒂 附 近 呈 黑 褐 色 或 尾 根呈 不 同 程 度 病 变 ， 剖 开 横 切 面 为 分 散 的 褐 色 小 斑点 或 黄 褐 色 至 深 褐 色 斑 块 ， 纵 切 面 从 藤 头 或 自 尾根 始 ， 维 管 束 呈 黄 褐 色 条 纹 状 ， 可 挤 出 乳 状 菌 脓 。重 症 薯 块 ， 整 块 呈 黑 褐 色 腐 烂 或 一 端 腐 烂 ， 有 脓液

25、 状 或 淡 黄 色 菌 液 ， 臭 味 浓 烈 。 甘 薯 黑 斑 病 茎 基 部 形 成 黑 褐 色 梭 形 或 椭 圆 形 病 斑 ， 稍 凹 陷 ，病 斑 初 期 有 灰 色 霉 层 ， 后 变 为 黑 色 粉 状 物 ， 病 斑 逐渐 扩 大 ， 重 者 基 部 全 部 变 黑 ， 枯 死 。 薯 块 上 形 成 黑 色 近 圆 形 病 斑 ， 病 部 稍 凹 陷 ，病 健 交 界 明 显 ， 组 织 坚 实 ， 如 用 刀 横 割 病 斑 部 ，可 见 薯 皮 下 的 薯 肉 呈 青 褐 色 或 黑 褐 色 ， 深 0.5cm2 cm， 有 强 烈 的 臭 味 。 病 部 木 栓

26、化 ， 坚 硬 ， 干 腐 ，在 适 当 条 件 下 ， 病 斑 中 央 会 长 出 黑 色 刺 毛 状 物 -子 囊 壳 。甘 薯 疮 痂 病 叶 片 卷 皱 呈 木 耳 形 ； 芽 僵 缩 ； 茎 蔓 和 叶 柄 生 出凸 凹 粗 糙 的 病 斑 ， 病 蔓 先 端 硬 化 僵 直 不 再 完 全 伏 地 ；顶 芽 受 害 病 斑 初 为 透 明 深 红 色 ， 扩 大 后 逐 渐 变 黑 褐色 而 枯 死 ； 新 梢 和 幼 叶 不 能 长 大 ， 整 个 顶 梢 收 缩 僵硬 而 直 立 ， 表 现 粗 糙 成 麻 脸 状 。 薯 块 表 面 产 生 暗 褐 色 至 灰 褐 色 小 点

27、 或 于 斑 ，干 燥 时 疮 痂 易 脱 落 ， 残 留 疹 状 斑 或 疤 痕 。 甘 薯 蔓 割 病 幼 苗 、 叶 脉 间 叶 肉 变 黄 ， 茎 内 维 管 束 变 褐 色 。潮 湿 时 ， 病 部 产 生 白 色 至 粉 红 色 的 霉 层 。 轻 者 分 枝增 生 和 节 间 缩 短 ， 茎 基 膨 大 ， 出 现 青 晕 ， 表 皮 似 裂呈 丝 状 。 罹 病 植 株 发 生 全 株 性 枯 萎 、 死 亡 ， 地 上 部叶 片 自 下 而 上 变 黄 脱 落 ， 茎 开 裂 。 维 管 束 变 褐 ， 横 切 薯 块 蒂 部 ， 可 见 褐 色 圆 环形 斑 点 ， 严 重

28、 时 ， 上 部 茎 蔓 枯 死 ， 而 薯 块 并 不 腐烂 ， 且 在 土 表 抽 出 很 多 幼 蔓 。甘 薯 根 腐 病 根 系 腐 烂 ， 多 从 不 定 根 的 尖 端 或 中 部 开 始 变 黑 ，逐 渐 向 上 蔓 延 至 根 茎 部 位 1 2个 叶 节 ， 形 成 黑 褐 色病 斑 。 病 斑 表 皮 纵 裂 ， 重 病 株 地 下 根 茎 大 部 分 变 黑 ，地 上 部 茎 蔓 缩 短 ， 分 枝 少 或 无 分 枝 ， 形 成 独 杆 苗 ， 一 般 不 结 薯 ， 轻 病 株 结 薯 畸 形 ， 呈 大 肠 状 或葫 芦 状 ， 表 皮 松 软 ， 表 面 小 病

29、斑 ， 用 手 一 拉 就 下来 ， 未 向 薯 肉 深 入 。 DB3301/T 10892018 7 叶 片 发 黄 、 反 卷 、 叶 变 小 ， 组 织 硬 化 且 脆 ， 叶 片 自下 而 上 干 枯 脱 落 ， 植 株 大 量 现 蕾 开 花 ， 常 造 成 大 片死 苗 ， 重 者 全 部 死 亡 。甘 薯 根 结 线虫 病 根 系 形 成 绳 结 状 ， 使 地 下 部 多 牛 蒡 状 ， 毛 根 纵生 ， 细 跟 上 有 米 粒 大 小 的 根 结 ， 有 的 成 串 ， 剥 开 根结 ， 可 见 一 至 数 个 雌 虫 。 龟 裂 型 ： 块 根 畸 形 ， 褐 色 纵 裂

30、 口棒 根 型 ： 粗 1 cm 2 cm， 棒 状 块 根线 根 型 ： 只 有 线 状 牛 蒡 根 ， 不 膨 大 成 薯 块 。甘 薯 茎 线 虫病 苗 期 ： 发 病 重 的 出 苗 稀 、 矮 小 、 发 黄 ， 剖 视 茎基 部 ， 内 有 褐 色 空 隙 ， 剪 断 后 不 流 或 很 少 流 白 浆 。后 期 侵 入 部 位 表 皮 裂 成 小 口 ， 髓 部 呈 褐 色 干 腐 状 ，剪 断 后 无 白 浆 。 茎 蔓 症 状 ： 主 蔓 基 部 髓 部 先 白 色 干 腐 ， 后 渐 变 褐 色 ， 严 重 时 基 部 蔓 短 、 叶 黄 ， 甚 至 主蔓 枯 死 。 根

31、部 症 状 ： 根 部 表 皮 坏 裂 。 糠 心 型 ： 薯 苗 、 种 薯 带 病 ， 先 块 根 纵 剖 面 内部 呈 稀 絮 状 白 色 糠 道 ， 后 期 由 于 伴 随 其 他 杂 菌 形成 褐 色 相 间 的 褐 色 糠 道 。 有 时 内 部 虽 毁 坏 ， 但 外表 接 近 健 者 。裂 皮 型 ： 发 病 轻 肉 眼 不 易 看 出 ， 开 始 外 皮 褪色 ， 不 久 变 青 ， 有 的 稍 凹 陷 ， 有 的 有 小 裂 口 ， 皮下 组 织 变 褐 ， 最 后 皮 色 呈 暗 紫 色 ， 并 多 龟 裂 ， 内呈 褐 白 相 间 的 干 腐 。甘 薯 茎 腐 病 甘

32、薯 茎 枝 在 发 病 初 期 ， 病 株 生 长 较 为 缓 慢 ， 在与 土 壤 接 触 的 茎 基 部 会 产 生 褐 至 黑 色 、 水 渍 状 的 病斑 ， 最 后 软 化 解 离 ， 导 致 枝 条 末 端 的 部 分 萎 凋 。 此外 ， 根 茎 维 管 束 组 织 有 明 显 的 黑 色 条 纹 、 并 有 恶 臭 。在 高 温 高 湿 的 条 件 下 ， 茎 部 腐 烂 迅 速 向 上 扩 展 ， 呈黑 色 ， 茎 、 叶 组 织 开 始 变 软 、 腐 烂 ， 整 个 植 株 发 病倒 伏 ， 最 后 全 株 枯 萎 死 亡 。 薯 块 表 面 有 黑 色 凹 陷 病 斑

33、,或 外 部 无 症 状 ， 内部 腐 烂 ， 受 侵 染 组 织 呈 水 浸 状 。 甘 薯 小 象 甲（ 蚁 象 ） 外 露 的 块 根 和 茎 叶 被 啃 食 ， 常 使 植 株 变 黄 ， 重者 死 亡 ， 造 成 田 间 缺 苗 。 幼 虫 危 害 薯 块 ， 取 食 成 蛀 道 ， 且 排 泄 物 充 斥于 蛀 道 中 ， 能 诱 导 薯 块 产 生 萜 类 和 酚 类 物 质 ， 使薯 块 变 苦 。 DB3301/T 10892018 8 BB附 录 B（ 资 料 性 附 录 ）斑 点 酶 联 免 疫 检 测 法 （ DOT-ELISA）B.1 试 剂所 用 化 学 试 剂 为

34、 分 析 纯 级 规 格 ， 用 水 为 蒸 馏 水 。B.1.1 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 （ TBS） （ pH7.5）Tirs Base 4.84g 氯 化 钠 （ NaCl） 58.44g叠 氮 钠 （ NaN3） 0.40g溶 于 1990ml蒸 馏 水 中 ， 用 盐 酸 （ 37%） 调 pH至 7.5， 定 容 至 2000ml。B.1.2 洗 涤 缓 冲 液 （ T-TBS）1.0ml吐 温 -20（ Tween-20） 溶 于 2000mlTBS中 。B.1.3 抽 提 缓 冲 液亚 硫 酸 钠 （ Na 2SO3） 0.2g溶 于 TBS中 ， 定 容 至 100m

35、l。B.1.4 封 闭 缓 冲 液 （ 现 用 现 配 ）脱 脂 奶 粉 0.50g粹 通 X-100（ Triton X-100） 0.5mlTBS 25ml先 将 脱 脂 奶 粉 溶 于 少 量 TBS中 ， 再 用 TBS定 容 至 25ml。 加 入 Triton X-100混 合 均 匀 。B.1.5 抗 体 稀 释 缓 冲 液脱 脂 奶 粉 1.00gTBS 50ml先 将 脱 脂 奶 粉 溶 于 少 量 TBS中 ， 再 用 TBS定 容 至 50ml。 B.1.6 底 物 缓 冲 液 （ pH9.5）Tris Base 6.05g氯 化 钠 （ NaCl） 2.92g氯 化 镁

36、 （ MgCl2 6H20） 0.51g叠 氮 钠 （ NaN3） 0.05g溶 于 450ml蒸 馏 水 中 ， 用 浓 盐 酸 调 pH至 9.5， 定 容 至 500ml。B.1.7 硝 基 蓝 四 唑 盐 （ NBT） 和 5-溴 -4-氯 -3-吲 哚 磷 酸 酯 （ BCIP） 储 备 液NBT储 备 液 ：NBT 0.04g DB3301/T 10892018 9 70%N,N-二 甲 基 甲 酰 胺 1.2ml混 合 均 匀 ， 4避 光 保 存 。BCIP储 备 液 ：BCIP 0.02g70%N,N-二 甲 基 甲 酰 胺 1.2ml混 合 均 匀 ， 4避 光 保 存 。

37、B.1.8 底 物 溶 液 （ 现 用 现 配 ）底 物 缓 冲 液 25mlNBT储 备 液 75lBCIP储 备 液 75l先 将 NBT储 备 液 溶 于 25ml底 物 缓 冲 液 中 ， 再 逐 滴 加 入 BCIP储 备 液 ， 边 加 加 振 摇 混 匀 。 B.2 样 品 制 备将 待 检 叶 片 用 清 水 清 洗 干 净 ， 从 每 一 样 品 叶 片 上 各 取 一 直 径 约 1cm圆 片 ， 放 入 样 品 袋 中 ， 加 入 3ml抽 提 缓 冲 液 充 分 研 磨 ， 4 静 置 30min 40min， 取 澄 清 汁 液 点 样 。 样 品 为 块 根 时 ，

38、 催 芽 处 理 后 取 幼 芽 、叶 制 样 。B.3 操 作 步 骤B.3.1 点 样将 打 好 方 格 的 硝 化 纤 维 素 膜 用 TBS缓 冲 液 处 理 后 放 在 洁 净 的 滤 纸 上 ， 每 个 样 品 各 吸 取 17l上 清 液 滴在 膜 上 方 格 的 正 中 ， 干 燥 15min 30min。 同 时 设 阳 性 、 阴 性 和 空 白 对 照 ， 可 根 据 需 要 设 置 重 复 。B.3.2 封 闭 将 干 燥 后 的 膜 浸 泡 在 封 闭 缓 冲 液 中 ， 室 温 下 摇 床 振 荡 （ 50r/min） 1h。B.3.3 孵 育 第 一 抗 体将 膜

39、 置 于 用 抗 体 缓 冲 液 稀 释 至 工 作 浓 度 的 抗 血 清 中 ， 室 温 下 摇 床 振 荡 （ 50r/min） 过 夜 。B.3.4 洗 涤用 洗 涤 缓 冲 液 洗 膜 3次 ， 每 次 摇 床 振 荡 （ 100r/min） 3min。B.3.5 孵 育 第 二 抗 体将 膜 置 于 用 抗 体 缓 冲 液 稀 释 至 工 作 浓 度 的 酶 标 抗 体 中 ， 室 温 下 摇 床 振 荡 （ 50r/min） 1 h。B.3.6 洗 涤洗 涤 4次 ， 方 法 同 A3.4。 B.3.7 显 色将 膜 置 于 NBT/BCIP 底 物 溶 液 中 ， 室 温 下

40、摇 床 振 荡 （ 50r/min） 孵 育 30min。 DB3301/T 10892018 10 B.3.8 终 止 反 应弃 去 底 物 溶 液 并 用 蒸 馏 水 洗 膜 3次 ， 每 次 摇 床 振 荡 （ 100r/min） 3min。B.3.9 阳 性 判 断晾 干 后 观 察 颜 色 反 应 ， 出 现 蓝 紫 色 颜 色 反 应 的 样 品 为 阳 性 。 DB3301/T 10892018 11 附 录 C（ 资 料 性 附 录 ）甘 薯 脱 毒 种 苗 标 准 化 生 产 模 式甘 薯 脱 毒 种 苗 标 准 化 生 产 模 式 参 见 图 C.1。 图 C.1 甘 薯 脱 毒 种 苗 标 准 化 生 产 模 式 图_