SN T 5227.9-2019 出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）.pdf

1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5227.9 2019 出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） Rapid detection of fox derived ingredient in food for export Recombinase-aid amplification (RAA) method 2019-12-27发布 2020-07-01 实施 ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5227.9 2019 I 前 言 SN/T 5227201

2、9出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）分为 11 个部分： 第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核

3、酸扩增法（RAA 法）； 第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）。 本部分为 SN/T 52272019 的第 9 部分。 本部分按照 GB/T 1.12009 的规则进行编写。 本部分由中华人

4、民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中国检验检疫科学研究院、郑州牧业经济学院、 浙江省食品药品检验研究院、中华人民共和国合肥海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国 厦门海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国福州海关、杭州众 测生物科技有限公司。 本部分主要起草人：苗丽、张九凯、张艳、张亚斌、沈泓、宗凯、罗宝正、孔繁德、郑秋月、 汪琳、郑晶、程奇。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5227.9 2019 出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 1 范围 本部分规定了出口食

5、品中狐狸源性成分的 RAA 检测方法。 本部分适用于出口食品中狐狸源性成分的定性检测。此标准所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.01%（W/W）。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 狐狸 Vulpes 食肉目，裂脚亚目，犬科，狐亚科，狐属。通称

6、狐狸，实际上是一类动物的统称。种类繁多，分 北极狐、赤狐、银黑狐、沙狐等。 3.1.2 实时荧光 RAA real-time RAA 一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术（简称 RAA 技术）。利用从细菌或真菌中获得的 重组酶，在恒温下（一般为 37 42 ），该重组酶可与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，在单 链 DNA 结合蛋白的帮助下，打开模板 DNA 的双链结构，当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹配 的互补序列时，在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的 DNA 互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光 探针的标记，随着 RAA 反应的进行，RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应

7、关系。 3.1.3 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.1.4 T 值 Time threshold 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5227.9 2019 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.2.1RAA ：recombinase-aid amplification，重组酶介导扩增。 3.2.2DNA ：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。 3.2.3CTAB ：cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。 3.2

8、.4Tris ：tris（Hydroxymethyl）aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。 3.2.5EDTA ：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。 3.2.6dNTPs ：deoxyribonuleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。 3.2.7SSB ：single stranded DNA binding protein，单链 DNA 结合蛋白。 3.2.8SC-recA ： Streptomyces coelicolor recombinase，天蓝色链霉菌重组酶。 3.2.9BS-recA ： Bacillus

9、subtilis recombinase，枯草芽孢杆菌重组酶。 3.2.10 Bsu ： Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌。 3.2.11Tricine ：N-tris Hydroxymethyl methylglycine，N- 三羟甲基甲基氨基酸。 4 方法提要 以提取的 DNA 为模板，采用狐狸的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧 光 RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中狐狸成分的检测鉴定。 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均 用无 DNA 酶污染的容器分装。 表 1

10、检测用引物和探针 物种名称 引物 / 探针序列（5 3 ） 扩增片段长度 靶基因 狐狸 F ：ACTATGGCTGAATTATCCGCTACATACATGC 185bp 线粒体细胞色素 b 基因（Cytb） R ：TCACGGTAAAACGTAGCCCATAAATGCTGTGGC P ：ATGGATCTTATGTATTCATAGAAACATGAAAFAM-dTTHF TBHQ-dTGGAATTATCTTATTG-C3spacer 注： 目的基因序列见附录 A。F 为上游引物，R 为下游引物，P 为探针，FAM-dT，THF，BQH-dT 和 C3spacer 均为探针修饰基团。 5.1 CTA

11、B 提取缓冲液（pH8.0）：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L Na 2 EDTA。 5.2 酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 =25 ： 24 ： 1。 5.3 异丙醇。 5.4 70 % 乙醇（V/V）。 5.5 TE 缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5227.9 2019 5.6 A Buffer（缓冲液 A）：20 % 聚乙二醇。 5.7 实时荧光 RAA 扩增体系：2.5 mmol/L dNT

12、Ps，225 ng/ L SSB，300 ng/ L recA 重组酶蛋白（SC- recA/BS-recA），75 ng/ L Bsu DNA 聚合酶，75 ng/ L Exo 核酸外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5 mmol/ L 二硫苏糖醇，250 ng/ L 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。 5.8 B Buffer（缓冲液 B）：280 mM 醋酸镁。 6 仪器设备 6.1 实时荧光 PCR 仪。 6.2 恒温荧光检测仪。 6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4 恒温水浴锅。 6.5 离心机：转速 12 000 r/min。 6.6 微量移

13、液器：量程 0.5 L10 L，10 L100 L，20 L200 L，200 L1 000 L。 6.7 研钵及粉碎装置。 6.8 涡旋震荡器。 6.9 离心管： 2 mL、1.5 mL。 7 检测步骤 7.1 DNA 提取 取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管中（若样品含杂质和调味品，可加入 1 mLdd H 2 O 洗涤两次），加入 600 L CTAB 提取缓冲液，涡旋震荡混匀后于 70 温育 15 min，期间颠倒离 心管2次3 次； 12 000 r/min 离心 5 min，取上清于一新的干净 1.5 mL 离心管中；加入 500 L 酚 ： 氯 仿

14、： 异戊醇（25 ： 24 ： 1），上下颠倒离心管 2 次 3 次后涡旋震荡混匀，12 000 r/min 离心 5 min ；转 移上层水相至一新的 1.5 mL 离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇，上下颠倒离心管 2 次 3 次，4 静置 30 min，4 下 12 000 r/min 离心 3 min，小心弃去上清液；加入 700 L 70 % 乙醇，重悬沉 淀，12 000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液；打开管盖，室温挥发干液体，加入 50 L100 L TE （pH8.0）缓冲液溶解 DNA，-20 保存备用。 DNA 提取也可采用等效 DNA 提取试剂盒进行。

15、7.2 DNA 浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。 DNA 的浓度按照公式（1）计算： c=A N50/1000 （1） 公式中： c=DNA 浓度，单位为微克每微升（ g/L ）； A=260 nm 处的吸光值； N= 核酸稀释倍数。 当 A 260 /A 280 比值在 1.71.9 之间时，适宜于 RAA 扩增。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5227.9 2019 7.3 实时荧光 RAA 扩增 7.3.1 实时荧光 RAA 反应总体系 表 2 实时荧光 RAA 反应总体系 试剂 体积 / L 实时荧光

16、RAA 扩增体系 20 L A Buffer 12.5 L 正向引物 (10 M) 2.0 L 反向引物 (10 M) 2.0 L 探针 (10 M) 0.6 L DNA 模板 (5 ng/ L) 2.0 L B Buffer 2.5 L 加 ddH 2 O至 50 L 7.3.2 实时荧光 RAA 反应程序 可选用以下两种扩增仪器之一进行检测，反应程序对应如下。 7.3.2.1 实时荧光 PCR 仪 39 ，60 s，1 个循环；39 ，30 s，40 个循环，在每次循环时收集荧光。 7.3.2.2 恒温荧光检测仪 39 ，1 min ；39 ，20 min，第二阶段开始收集荧光。 7.3.

17、3 实验对照 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有狐狸源成分的样品作为阳性对照样 品，不含狐狸源成分的样品作为阴性对照，以与模板等体积的双蒸水作为空白对照。 8 质量控制 8.1 实时荧光 PCR 仪 8.1.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。 8.1.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。 8.1.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值 30.0。 8.2 恒温荧光检测仪 8.2.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。 8.2.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（

18、时间）。 8.2.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 T 值（时间） 15 min。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5227.9 2019 9 结果判断与表述 9.1结果判定 9.1.1 实时荧光 PCR 仪 9.1.1.1 在符合条款 8.1 的情况下，结果才能判为有效。 9.1.1.2 如 Ct 值 35.0，则判定被检样品阳性。 9.1.1.3 如 35.0 Ct 值 40.0，则重复一次。如再次检测结果仍然是 35.0 Ct 值 40.0，则判定 为被检样品阳性。 9.1.1.4 如无报告 Ct 值或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。 9.1.2 恒

19、温荧光检测仪 9.1.2.1 在符合条款 8.2 的情况下，结果才能判为有效。 9.1.2.2 如 T 值（时间） 15 min，则判定被检样品阳性。 9.1.2.3 如 15 min T 值（时间） 20 min，则重复一次。如再次检测结果仍然是 15 min T 值（时 间） 20 min，则判定为被检样品阳性。 9.1.2.4 如无报告 T 值（时间）或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。 9.2 结果表述 9.2.1 样品阳性，表述为“检出狐狸成分”。 9.2.2 样品阴性，表述为“未检出狐狸成分”。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 274

20、032008 中附录 D 的规定执行。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5227.9 2019 附 录 A （资料性附录） 狐狸源性成分的基因扩增靶标参考序列 ACTATGGCTGAATTATCCGCTACATACATGC AAACGGAGCATCTATATTTTTTATCTGCCTCTTCATG CACGTGGGACGAGGCTTATATT ATGGATCTTATGTATTCATAGAAACATGAAATATTGGAATTATCTTAT TG TTCGCAACCATG GCCACAGCATTTATGGGCTACGTTTTACCGTGA 注：加方框部分为引物结合区域，阴影部分为探针结合区域。

21、 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN / T 5227.92019 SN/T 5227.9 2019 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 24 千字 2020 年 月第一版 2020 年 月第一次印刷 印数 1500 书号： 1551752 定价 16.00 元 出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 行 业 标 准 SN/T 5227.92019 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址