SN T 5371-2021 国境口岸血吸虫PCR和荧光PCR检测方法.pdf

1、ICS11.020 CCSC62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T53712021 国境口岸血吸虫PCR和荧光PCR检测方法 Detection method of schistosoma by PCR and real-time fluorescence PCR at frontier ports 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 国境口岸血吸虫PCR和荧光PCR检测方法 SN / T 5371 2021 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号( 100023 )

2、 编辑部:( 010 ) 65194242-7531 网址 / book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本8801230 1 / 16 印张0.75 字数22千字 2021年7月第一版 2021年7月第一次印刷 印数 1 500 * 书号: 155175 661 定价12.00元 前 言 本文件按照 GB / T 1.1 2020 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规 定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国成都海关、中华人民共和国重庆海关、中华人民共和国福州海关。 本文件主要起草人:田绿波、石莹、骆星丹、何纬、黄恩炯、樊

3、学军、辛文瀚、王俊贤。 SN/T53712021 国境口岸血吸虫PCR和荧光PCR检测方法 1 范围 本文件规定了国境口岸日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫PCR和三重实时荧光PCR检测的对 象、检测方法、生物安全及结果报告。 本文件适用于国境口岸日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫的实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN / T 1193 基因检验实验室技术要求

4、WS / T 230 临床诊断中聚合酶链反应( PCR )技术的应用 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 血吸虫 schistosoma 属于扁形动物门吸虫纲裂体吸虫科,也称裂体吸虫。寄生于人体的有日本血吸虫、埃及血吸虫和曼 氏血吸虫等,可引起血吸虫病。其幼虫在中间宿主螺类体内发育,尾蚴通过皮肤、粘膜进入人体内,可侵 及肺、胃肠道、泌尿和中枢神经系统,有些虫卵随血流进入各器官,引起各种症状,如肝肿大,严重时造成 宿主死亡。日本血吸虫主要见于中国大陆、日本、中国台湾、东印度群岛和菲律宾;埃及血吸虫主要分布 于非洲、南欧和中东;曼氏血吸虫主要分布于非洲和南美洲北部。血吸虫感染后会

5、出现皮疹、发热、腹 痛、腹泻、乏力、肝脏不适等症状,严重危害人类的健康。日本血吸虫、曼氏血吸虫成虫主要寄生于人体 肠系膜下静脉,埃及血吸虫成虫主要寄生于膀胱静脉丛。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEPC :焦碳酸乙二酯( dieth y l py rocarbonate ) PAGE :聚丙烯酰胺凝胶电泳( p ol y acr y lamide g el electro p horesis ) FAM : 6-羧基荧光素( 6-carbox y fluorescein ) BHQ :黑洞淬灭基团( black hole q uencher ) 5 检测对象 5.1 国境口岸发现的有

6、皮疹、发热、腹痛、腹泻、乏力、肝脏不适等症状,疑似血吸虫感染病人。 1 SN/T53712021 5.2 来自血吸虫感染疫区人员。 5.3 其他申请检验的人员。 6 生物安全和PCR防污染要求 实验室生物安全和运输要求应符合GB 19489的规定。 PCR防污染措施按SN / T 1193和WS / T 230的规定执行。 7 主要试剂 7.1 无RNA酶的DEPC水。 7.2 DNA提取液(含0.9% NaCl和0.1% EDTA-Na 2的混合液)。 7.3 引物应用液浓度配制成20 mol / L ,引物和探针见表1 。等效商品化试剂也可使用。 表1 血吸虫PCR和实时荧光PCR检测引物

7、及探针 引物及探针名称序列( 5 -3 )扩增片段 日本血吸虫PCR检测引物 S j -F1 5 - GGTTATGGTTTGTTGATGTTAGG -3 S j -R1 5 - ACTAATTCACTCTCGGACTCACC -3 269 b p 曼氏血吸虫PCR检测引物 Sm-F1 5 - AGTTACTRGGAAAGGTGAAAGTGC -3 Sm-R1 5 - CACTAAAACACTCCTTATACCRGG -3 350 b p 埃及血吸虫PCR检测引物 Sh-F1 5 - GCGGATGATTTTCGTTGTTAGG -3 Sh-R1 5 - TTCAGACTCGGAATAGTCA

8、CATGG -3 398 b p 日本血吸虫实时 荧光PCR检测引物 S j -F 5 - GGGGTTTGTATTATAAGTTTATGATGTT -3 S j -R 5 - CACACGAACAGCACTAATCAATC -3 S j -P 5 -FAM- CCAAGAACCTCAACCTAACATCAACAA - BHQ1-3 125 b p 曼氏血吸虫实时荧光 PCR检测引物及探针 Sm-F 5 - AGTAAGTGAGAATAATCGTACGCC -3 Sm-R 5 - GGAATAAACATCATAGCATATTCACA -3 Sm-P 5 -HEX- ACACCACTCACAAG

9、CTCACTCT-BHQ1-3 135 b p 埃及血吸虫实时 荧光PCR检测引物 Sh-F 5 - GGCATGGTTAATAGTRTTATTAAGAGAG -3 Sh-R 5 - GGAATACTCGCAAGCAAATATAAC -3 Sh-P 5 -Red 610- AGTAATCGTACACCATGTGACTATTC- BHQ2-3 139 b p 注: 引物序列中的简并碱基 R表示G或A 。 7.4 PCR基础试剂:市售商品化试剂。 7.5 电泳缓冲液( 10TBE ):称取108 g Tris碱, 7.44 g Na 2 EDTA H 2 O和55 g硼酸,溶于800 mL 的dd

10、H 2 O中,充分搅拌溶解后加水定容至1 L ,室温保存。 7.6 GoldenView核酸染料(或其他等效核酸染料):使用浓度为5 L / 50 mL 。 2 SN/T53712021 8 主要仪器 主要仪器设备如下: 二级生物安全柜; 台式高速冷冻离心机(最高离心力12 000 g以上); 涡旋振荡器; 冰箱: 4 和-20 ; 超净工作台; 微型离心机; PCR仪; 荧光定量PCR仪; 凝胶成像分析系统; 电子天平(d=1 m g ); 微波炉; 电泳仪; 高压灭菌锅; 超纯水器或双蒸水器; 微量可调移液器一套(含以下5种规格: 10 L 、 20 L 、 100 L 、 200 L 、

11、 1 mL )。 9 样品采集与运输 9.1 样品采集 9.1.1 粪便标本 采集新鲜粪便于一次性无菌采便管内,成形便采集5 g 8 g ,水样便采集1 mL3 mL 。采便管外 表贴上带有唯一识别号码的标签,直接用于检测,或保存,或送检。 9.1.2 尿液标本 用无菌容器采集3 mL5 mL ,密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标签,直接用于检测,或保存, 或送检。 9.1.3 血液 用无菌容器采集2 mL3 mL抗凝血(非肝素),密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标签,直接用 于检测,或保存,或送检。 9.2 样本的运送与保存 样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。对于不立即检测的样本,应

12、保存于-20 及以下 待检。 3 SN/T53712021 10 实验室检验 10.1 样品处理 取黄豆大小约100 m g 200 m g的粪便,加入500 L的生理盐水,振荡混匀,制成20 %40 %的 混悬液;或取2 mL血液,静置待自然分层,吸取上层血浆层及中层Buff y coat层;或取3 mL尿液。然 后16 200 g离心2 min 。弃去上清。不能立即进行检测时,样本冻存于-20 冰箱备用。 10.2 核酸提取 在标本的前处理沉淀中,加入100 L DNA提取液( 7.2 )充分混匀,沸水浴10 min (误差不超过1 min )。 16 200 g 离心 5 min ,上清

13、可直接用于PCR反应。也可以使用商品化的DNA提取试剂盒并按 其说明书操作。 10.3 空白对照和阴、阳性对照设置 检测过程中分别设空白对照和阴、阳性对照。阴性对照为不含血吸虫核酸的标本。阳性对照为日 本、埃及、曼氏血吸虫阳性样本核酸,或者为克隆的日本、埃及、曼氏血吸虫部分DNA序列(必须包含扩 增区域在内),序列见附录A 。空白对照为ddH 2 O 。 10.4 PCR检测 10.4.1 反应体系组成 10.4.1.1 日本血吸虫反应体系为40 L ,组成如下: Master Mix (含PCR缓冲液、 dNTP 、 M g 2+ 、Tap酶) 干粉球 DEPC水35 L S j -F1 (

14、 20 mol / L ) 0.5 L S j -R1 ( 20 mol / L ) 0.5 L 模板4 L 10.4.1.2 曼氏血吸虫反应体系为40 L ,组成如下: Master Mix (含PCR缓冲液、 dNTP 、 M g 2+ 、Tap酶)干粉球 DEPC水35 L Sm-F1 ( 20 mol / L ) 0.5 L Sm-R1 ( 20 mol / L ) 0.5 L 模板4 L 10.4.1.3 埃及血吸虫反应体系为40 L ,组成如下: Master Mix (含PCR缓冲液、 dNTP 、 M g 2+ 、Tap酶)干粉球 DEPC水35 L Sh-F1 ( 20 mo

15、l / L ) 0.5 L Sh-R1 ( 20 mol / L ) 0.5 L 模板4 L 10.4.2 PCR扩增 循环参数设置: 94 5 min ; 94 15 s , 58 20 s , 72 30 s ,循环40次; 72 10 min ;因 不同PCR仪器的性能差异,可根据条件优化适当调整PCR退火温度和时间。 4 SN/T53712021 10.4.3 琼脂糖凝胶电泳 用0.5TBE电泳缓冲液配制2.0% (质量分数)的琼脂糖凝胶(含GoldenView或其他等效核酸染 料)。将琼脂糖凝胶放入水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面。取5 L普通RT-PCR扩增产物和 1 L上样缓

16、冲液混匀后加入糖凝胶的样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照,使用100 b p DNA 分子量标准。按 8 V / cm的电压条件电泳约30 min40 min 。采用凝胶成像分析系统观察核酸 条带并判断结果。 10.4.4 检验结果判断及报告 10.4.4.1 当阳性对照出现目的片段条带,而阴性对照和空白对照没有任何核酸条带出现时才可对样 本进行结果判定及报告,否则视为实验失败,需重新实验。 10.4.4.2 本方法检验结果判定及报告如下。 日本血吸虫反应体系检测样品出现269 b p条带时,报告检出日本血吸虫特异性基因( PCR法, 269 b p );否则报告日本血吸虫核酸检测阴性

17、。 曼氏血吸虫反应体系检测样品出现350 b p条带时,报告检出曼氏血吸虫特异性基因( PCR法, 350 b p );否则报告曼氏血吸虫核酸检测阴性。 埃及血吸虫反应体系检测样品出现398 b p条带时,报告检出埃及血吸虫特异性基因( PCR法, 398 b p );否则报告曼氏血吸虫核酸检测阴性。 10.4.5 测序 对于检测阳性的样本可切下电泳分析的目的条带,用凝胶回收试剂盒回收纯化(按其说明书进行), 全自动遗传分析仪进行测序,确认基因序列,也可进一步分析基因的变异情况。 10.5 实时荧光PCR检测 10.5.1 引物和探针 参见7.3 。 10.5.2 反应体系组成 反应体系为40

18、 L ,组成如下: Master Mix (含PCR缓冲液、 dNTP 、 M g 2+ 、 Ta p酶)干粉球 DEPC水29.5 L S j -F ( 20 mol / L ) 0.6 L S j -R ( 20 mol / L ) 0.6 L S j -P ( 20 mol / L ) 0.1 L Sm-F ( 20 mol / L ) 1.2 L Sm-R ( 20 mol / L ) 1.2 L Sm-P ( 20 mol / L ) 0.2 L Sh-F ( 20 mol / L ) 1.2 L Sh-R ( 20 mol / L ) 1.2 L Sh-P ( 20 mol / L

19、 ) 0.2 L 模板4 L 5 SN/T53712021 10.5.3 PCR扩增 10.5.3.1 反应管置于荧光定量PCR仪上,推荐循环参数设置: 37 2 min , 94 2 min ; 93 15 s , 60 60 s ,循环40次;单点荧光检测在60 。 10.5.3.2 荧光通道检测选择:选择FAM 、 HEX和CY5通道。 10.5.3.3 因不同荧光PCR仪的性能差异,可通过条件优化适当调整PCR循环的温度和时间。 10.5.4 检验结果判断及报告 10.5.4.1 基线和阈值设定 基线一般设定取615个循环,具体可根据实际情况调整,调整原则为选择指数扩增前荧光信号较 稳

20、定的区域,起点避开荧光采集起始阶段的信号波动,终点比最早出现指数扩增的样本Ct值减少12 个循环。阈值设定原则以阈值线刚好超过空白对照品的检测荧光曲线的最高点,也可根据仪器噪音情 况调整。 10.5.4.2 质量控制 空白对照和阴性对照在FAM 、 VIC和CY5通道检测结果应为UNDET ,且无明显的扩增曲线;阳 性对照在FAM 、 HEX和Red 610通道检测结果Ct值均35 ,且有明显的扩增曲线;否则实验视为 无效。 10.5.4.3 检测结果的判定 检测结果的判定应见表2 。 表2 血吸虫三重实时荧光PCR检测结果判定 通道Ct值结果判断 FAM 35报告为日本血吸虫荧光PCR检测阳

21、性 UNDET或40检测样品低于检测限,报告为日本血吸虫荧光PCR检测阴性 3540 待检标本Ct值在3540之间时,重复检测一次,若重新检测的Ct值仍介 于35和40之间,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性;否则建议采用浓 缩方式处理核酸样本,再重新进行荧光PCR检测,若重新检测的Ct值有明 显减少趋势,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性,否则判为阴性 HEX 35报告为曼氏血吸虫荧光PCR检测阳性 UNDET或40检测样品低于检测限,报告为曼氏血吸虫荧光PCR检测阴性 3540 待检标本Ct值3540之间时,重复检测一次,若重新检测的Ct值仍介于 35和40之间,且曲线有明显的对数增长期,

22、判为阳性;否则建议采用浓缩 方式处理核酸样本,再重新进行荧光PCR检测,若重新检测的Ct值有明显 减少趋势,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性,否则判为阴性 CY5 35报告为埃及血吸虫荧光PCR检测阳性 UNDET或40检测样品低于检测限,报告为埃及血吸虫荧光PCR检测阴性 3540 待检标本Ct值3540之间时,重复检测一次,若重新检测的Ct值仍介于 35和40之间,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性;否则建议采用浓缩 方式处理核酸样本,再重新进行荧光PCR检测,若重新检测的Ct值有明显 减少趋势,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性,否则判为阴性 6 SN/T53712021 10.6 检

23、测注意事项 10.6.1 血液样本可检测日本血吸虫、埃及血吸虫、曼式血吸虫;粪便标本可检测日本血吸虫和曼式血 吸虫;尿液标本可检测埃及血吸虫。 10.6.2 实验室环境污染,试剂污染,样品交叉污染会出现假阳性结果;试剂运输,保存不当或试剂配制 不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或检测不准确的结果。 SN/T53712021 SN/T 53712021 附 录 A (资料性) 阳性对照基因合成序列及GenBank参考序列编号 A.1 日本血吸虫 GenBank参考序列编号: KU196379.1 。 阳性对照基因合成序列如下: GGGGTTTGTATTATAAGTTTATGATGTTGTA

24、CATTTTAATTTTGTCTACTTTTACTGGTT ATGGTTTGTTGATGTTAGGTTGAGGTTCTTGGAAAAAGTATAGATTGATTAGTGCTGTTC GTGTGGCTTTTGCTAGAATAAGGTTTGAAGCTACTTTTATGTGTTTAGTATTAGTATTGG GTGTAATATATAATGATTATGGTAAATTGGATATTACTTATTTGATTGTTATTGCTCCAT TAAATTATTTTGCTTGGTCTGTTTCTTTGCTTGCTGAAAGAAAACGTTCTCCATTTGATT ATGGTGAGTCCGAGAGTGAATTAGT

25、A.2 曼氏血吸虫 GenBank参考序列编号: HE601612.1 。 阳性对照基因合成序列如下: AGTAAGTGAGAATAATCGTACGCCCTTAGATTATGGGGAGTGTGAGAGTGAGCTTGTGAG TGGTGTAACAGTGGAGTATAGAAGTGTATTGTTCTTAGTGATATTTGCTTGTGAATATGC TATGATGTTTATTCCAGTTACTGAGAAAGGTGAAAGTGCATGGTTTCAATTTTCGAAGGT GATTTTCAGTATTTGGGTGTATAGTTATGGTAGTATGTTTTTTAGTTAGGGTTGAGATTT ACGG

26、AATGTTTCAAAGTGGTATCGATAGGTGGTATGCGTTATTATATTTTTTAGTTGTTT TTTCTTTTTTGGGTTATGGTATACTGTTATTAGGGTGATGTTCATGATCTAAGTATAGGT TAATAAGGTGTATTCGGGTTTCTTTTTCTAAAGTGATGTTTGAAATGATATTTATGTGTA TATTAATCTTGTTTGGTTATTTATATTTTGGTTATGGTGATCCTGGTATAAGGAGTG TTTTAGTG A.3 埃及血吸虫 GenBank参考序列编号: GU257392.1 。 阳性对照基因合成序列如下: GC

27、GGATGATTTTCGTTGTTAGGTTGTATAATTTTAATTTCATGTTCAGTATCAATGGTAG TAGTTTATAGATTAATAAATAGGAATATATGATGTAATTGAATATTACTTTATTTTTTA GTAGTAGGTTCTATAGTAAGTTATAGAACTTTATTAATAGGCTGATGTTCGTGATCAAAG TACAGTCTAATCAGTTCTATTCGTGTTTCTTTTTCTAGTGTGATGTTCGAAATGATACTG ATGTGCATTATAATTTTGTTTGGTTTAATGTATGGTGGTTATAGAAAACCTAGAATTAG AAGAGTAATGATATTTATAGCACCTTTAGTTTTTATTGCATGGTTAATAGTATTATTAA GAGAGAGTAATCGTACACCATGTGACTATTCCGAGTCTGAAAGTGAATTAGTAAGAGGAA TTAGAGTGGAATATAGGAGAGTATTATTTTTAGTTATATTTGCTTGCGAGTATTCC 1 2 0 2 1 7 3 5 T/ N S 版权专有 侵权必究 * 书号: 155175 661 定价: 12.00元