SN T 4624.18-2021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第18部分：短短芽孢杆菌.pdf

1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.18 2021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第 18 部分：短短芽孢杆菌 Test method of import microbe agentia in the environment protection - Part 18: Brevibacillus brevisr 2021-06-18 发布 2022-01-01 实施 ICS 11.020 CCS C 62 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 4624.18 2021 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12

2、020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规 定起草。 本文件为 SN/T 4624入境环保用微生物菌剂检测方法的第 18 部分。SN/T 4624 已经发布了以 下部分： 第 1 部分：地衣芽孢杆菌 第 2 部分：短小芽孢杆菌 第 3 部分：巨大芽孢杆菌 第 4 部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 第 5 部分： 型溶血性链球菌 第 6 部分：金黄色葡萄球菌 第 7 部分：沙门氏菌 第 8 部分：志贺氏菌 第 9 部分：致泻大肠埃希氏菌 第 10 部分：淡紫拟青霉 第 11 部分：雅致小克银汉霉 第 12 部分：哈茨木霉 第 13 部分：黄孢原毛平革菌 第 14 部分：焦曲霉 第

3、 15 部分：解淀粉芽孢杆菌 第 16 部分：类产碱假单胞菌 第 17 部分：恶臭假单胞菌 第 18 部分：短短芽孢杆菌 第 19 部分：红串红球菌 第 20 部分：泛养副球菌 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国沈阳海关、二连浩特国际旅行卫生保健中心。 本部分主要起草人：王金玲、张莹、杨喜凤、罗力涵、李大力。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 4624.18 2021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第 18 部分 短短芽孢杆菌 1 范围 本文件规定了入境环保用微生物菌剂短短芽孢杆菌（ Brevibacillus brevis）的形态学

4、鉴定、生化鉴 定、实时荧光 PCR 检测方法。 本文件适用于入境环保用微生物菌剂短短芽孢杆菌检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文件的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 4 短短芽孢杆菌分类地位 学名： Brevibacillus brevis。 分类地位：芽孢杆菌科（Bacillaceae），短芽孢杆菌属（ Brevibacillus）。 5 方法原理

5、分离纯化菌株后，进行形态学鉴定、生化鉴定、实时荧光 PCR 检测，根据菌的形态特征结果、 生化鉴定结果、实时荧光 PCR 特异性片段扩增结果，3 项结果都符合时判断该菌是否为目标菌株。 6 仪器设备 6.1 电子天平（感量 0.01 g）。 6.2 恒温培养箱：30 1 、50 1 。 6.3 恒温振荡培养箱：30 1 。 6.4 恒温水浴锅。 6.5 台式冷冻离心机（最高转速 15 000 r/min）。 6.6 PCR 扩增仪。 6.7 生物显微镜：10100。 以正式出版文本为准 2 SN/T 4624.18 2021 6.8 厌氧培养装置：30 1 。 6.9 微量移液器和灭菌吸头：1

6、0 L、20 L、200 L、1 000 L。 6.10 高压灭菌锅。 6.11 PCR 超净工作台。 6.12 电泳仪。 6.13 核酸 / 蛋白分析仪。 6.14 凝胶成像系统。 6.15 无菌培养皿：直径 90 mm。 7 主要试剂和培养基 7.1 实验用水（应符合 GB/T 6682 中一级水的规格）。 7.2 营养琼脂：按附录 A 中 A.1 配制。 7.3 营养肉汤：按附录 A 中 A.2 配制。 7.4 革兰氏染色法相关试剂：按附录 A 中 A.3 配制。 7.5 芽孢染色法相关试剂：按附录 A 中 A.4 配制。 7.6 接触酶：按附录 A 中 A.5 配制。 7.7 氧化酶：

7、按附录 A 中 A.6 配制。 7.8 糖发酵管（葡萄糖、木糖、L - 阿拉伯糖、甘露醇）：按附录 A 中 A.7 配制。 7.9 硝酸盐还原：按附录 A 中 A.8 配制。 7.10 7 %NaCl 生长：按附录 A 中 A.9 配制。 7.11 淀粉水解：按附录 A 中 A.10 配制。 7.12 明胶：按附录 A 中 A.11 配制。 7.13 TE 缓冲液（pH 值 8.0）：按附录 A 中 A.12 配制。 7.14 1 %3 % 琼脂糖凝胶：按附录 A 中 A.13 配制。 7.15 25 mM EDTA ：按附录 A 中 A.14 配制。 7.16 3 M 醋酸钠：按附录 A 中

8、 A.15 配制。 7.17 dNTP ：dATP、dTTP、dGTP、dCTP 配制。 7.18 TBE ：按附录 A 中 A.16 配制。 7.19 Taq DNA 聚合酶。 7.20 细菌基因组 DNA 提取试剂盒。 7.21 琼脂糖。 7.22 溴化乙锭。 7.23 DNA 分子量标记：100 bp DNA l adder。 8 样品制备、培养 8.1 以无菌操作取 1 g（mL）样品加入到 100 mL 生理盐水中混匀，移取 1 环菌连续划线接种 5 个营 养琼脂平板，30 1 培养 18 h24 h。取样过程中，在样品旁边放置 1 个营养琼脂平板作为空白 对照。 8.2 挑取平板上

9、 35 个菌落平坦、光滑，色泽白色，生长后期一般黄灰色的菌落进行形态学鉴定。 8.3 挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养，30 1 条件下培养 18 h24 h ；再从 纯培养平板上挑取菌落接种营养肉汤，30 1 条件下 180 r/min 振荡培养 18 h24 h。 以正式出版文本为准 3 SN/T 4624.18 2021 9 形态学鉴定 9.1 培养性状 短短芽孢杆菌在营养琼脂上的菌落平坦、光滑，色泽白色，生长后期一般黄灰色。 9.2 形态特征 革兰氏染色及芽孢染色：将 8.2 中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，将该平板在冰箱中放置 48 h 待形成芽孢后，进行芽孢染色，镜

10、检。 短短芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，菌体宽度 1.2 m1.5 m，长度 2.0 m5.0 m，内生孢子，芽 孢不膨大，不形成伴胞晶体。 10 生化鉴定 也可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等。 取 8.3 中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每个生化管加入 100 L 增菌肉汤。 短短芽孢杆菌生化特征见表 1。 表 1 短短芽孢杆菌生化特征 鉴定项目 短短芽孢杆菌 接触酶 + 氧化酶 +/- 厌氧生长 + 葡萄糖 + 木糖 - L- 阿拉伯糖 - 甘露醇 + 硝酸盐还原 + 50 生长 + pH 值 5.7 生长 - 7 % NaCl 生长 + 淀粉水解 - 明胶液化 + 11

11、 分子生物学检测 11.1 细菌模板 DNA 的提取 11.1.1 直接提取法 取 8.3 中菌液 1 mL 加到 1.5 mL 无菌离心管中，10 000 r/min 离心 2 min，尽量弃净上清液（如果 以正式出版文本为准 4 SN/T 4624.18 2021 肉眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作）。沉淀加入 TE 100 L、10 mg/mL 溶菌酶 100 L， 37 温育 30 min，12 000 r/min 离心 2 min，沉淀加入 TE 缓冲液 600 L 重悬，再加入 15 mg/mL 蛋白 酶 25 L，55 温育 1 h 后沸水浴 10 min，12 000

12、 r/min 离心 5 min，取上清液保存于 -20 保存以 待检测。 11.1.2 有机溶剂提取法 取 8.3 中菌液 1 mL 加到 1.5 mL 无菌离心管中，10 000 r/min 离心 2 min，尽量弃净上清液（如果 肉眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作）。沉淀加入 TE 缓冲液 570 L 重悬，然后加入 10 mg/mL 溶菌酶 100 L，37 温育 30 min，再加入 10 % SDS 30 L，65 温育 10 min，加入等体积 的酚混匀，12 000 r/min 离心 10 min，取上清液移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清 液加等体积的酚氯

13、仿（11，体积比）混匀，12 000 r/min 离心 10 min，取上清液再移入一新离心 管中，加等体积的无水乙醇，1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12 000 r/min 离心 10 min， 弃上清液，沉淀用 500 L75 % 乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇浑发，加入 100 L无 菌水（预先加热至 65 有利于 DNA 溶解），-20 保存以待检测。 11.1.3 试剂盒法 使用商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。 11.1.4 DNA 质量检测 用核酸 / 蛋白分析仪分别在 260 nm 和 280 nm 下测定

14、 OD 值，用于实时荧光 PCR 反应的 DNA 纯 度一般为 1.6 OD 260 /OD 280 2.0。 DNA 纯度 =OD 260 / OD 280 DNA 浓度（mg/mL）=50OD 260 11.2 实时荧光 PCR 鉴定 11.2.1 引物和探针序列 引物和探针序列见表 2。其中探针的 5 端标记 FAM，3 端标记 TAMRA。 表 2引物和探针序列 鉴定菌名称 引物序列 探针序列 短短芽孢杆菌 cell wall protein precursor, gene GenBank AF424046.1 5- GCGCCGCAACTTTTGATT-3 5FAM-CTCAGGCG

15、TTTAATAGG-TAMRA3 5- CACAATTCCCCGTTTTTCGT-3 11.2.2 实时荧光 PCR 反应体系 实时荧光 PCR 反应体系见表 3。 表 3实时荧光 PCR 反应体系 试剂名称 实时荧光 PCR 反应体系 2.5Real Master Mix 12.5 L 正向引物（ 10 pmol/L） 1 L 以正式出版文本为准 5 SN/T 4624.18 2021 表 3 （续） 试剂名称 实时荧光 PCR 反应体系 反向引物 (10 pmol/L) 1 L 探针 (5 pmol/L) 1 L DNA 模板 2 L（约 50 ng200 ng） 50ROX Refere

16、nce Dye*3 0.25 L ddH 2 O 补充至 25 L 注 1 ：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。 注 2 ： 50ROX Reference Dye*3 荧光试剂仅在具有 ROX 校正通道的实时荧光 PCR 仪上进行扩增添加，否则 用超纯水补足。 注 3 ：检测样品设置两个平行反应。 11.2.3 实时荧光 PCR 反应参数 实时荧光 PCR 反应参数见表 4。 表 4 实时荧光 PCR 反应参数 循环 步骤 温度/ 时间 内容 1 1 94 15 min 起始模板变性 40 2 94 3 s PCR 循环中模板变性 3 59 32 s 退火延伸

17、 注 1 ：使用不同实时荧光 PCR 仪，可对参数作适当调整。 注 2 ： 设置实时荧光 PCR 反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪 器使用说明书。 11.2.4 实验对照的设立 11.2.4.1 阴性对照：非短短芽孢杆菌 DNA 为模板。 11.2.4.2 阳性对照：已知短短芽孢杆菌的 DNA 或含有待测基因序列的质粒为模板（参见附录 B）。 11.2.4.3 空白对照：设两个，一是提取 DNA 时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是 实时荧光 PCR 反应的空白对照（以水代替 DNA 模板）。 11.2.5 实时荧光 PCR 扩增结果判定 1

18、1.2.5.1 对照结果 11.2.5.1.1 阴性对照：无扩增曲线。 11.2.5.1.2 阳性对照：出现典型的扩增曲线， Ct 值应 30.0。 11.2.5.1.3 空白对照：无扩增曲线。 11.2.5.1.4 否则，检测视为无效。 11.2.5.2 结果判定 11.2.5.2.1 Ct 值大于等于 40.0，可判定该样品实时荧光 PCR 结果为阴性。 11.2.5.2.2 Ct 值小于等于 35.0，可判定该样品实时荧光 PCR 结果为阳性。 以正式出版文本为准 6 SN/T 4624.18 2021 11.2.5.2.3 Ct 值大于 35.0 且小于 40.0，建议重做。再次扩增后

19、的外源基因 Ct 值仍小于 40，且曲线 有明显的对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为阳性；再次扩增后 外源基因 Ct 值大于 40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定为阴性。 12 结果报告 12.1 形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测结果均符合时，报告检出短短芽孢杆菌。 12.2 形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测有一项不符合时，建议重做。仍有不符合时，报告未 检出短短芽孢杆菌。 以正式出版文本为准 7 SN/T 4624.18 2021 附 录 A （规范性） 培养基和试剂 A.1 营养琼脂培养基 A.1.1 成分 蛋白胨 10 g 牛肉膏 3

20、 g 氯化钠 5 g 琼脂 15 g20 g 蒸馏水 1 000 mL A.1.2 制法 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入 15 % 氢氧化钠溶液约 2 mL 校正 pH 值至 7.27.4。 加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121 高压灭菌 15 min。 A.2 营养肉汤 A.2.1 成分 蛋白胨 10 g 牛肉膏 3 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1 000 mL A.2.2 制法 将各成分溶解于蒸馏水内，加入 15 % 氢氧化钠溶液校正 pH 值至 7.27.4，加热煮沸，分装烧瓶， 121 高压灭菌 15 min。 A.3 革兰氏染色法相关试剂 A.3.1 结晶紫染色

21、液 结晶紫 1 g 95 % 乙醇 20 mL 1 % 草酸铵水溶液 80 mL 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.3.2 革兰氏碘液 碘 1 g 碘化钾 20 g 蒸馏水 300 mL 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300 mL。 以正式出版文本为准 8 SN/T 4624.18 2021 A.3.3 沙黄复染液 沙黄 0.25 g 95 % 乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A.3.4 染色法 A.3.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色 1 min，水洗。 A.3.4

22、.2 滴加革兰氏碘液，作用 1 min，水洗。 A.3.4.3 滴加 95 % 乙醇脱色，约 30 s ；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个 涂片，脱色 10 s。 A.3.4.4 水洗，滴加复染液，复染 1 min。水洗，待干，镜检。 A.3.5 结果 革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。 A.4 芽孢染色液相关试剂 A.4.1 5% 孔雀绿水溶液 孔雀绿 5 g 蒸馏水 100 mL 将孔雀绿加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 100 mL。 A.4.2 0.5% 沙黄水溶液 沙黄 0.5 g 蒸馏水 100 mL 将沙黄加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全

23、溶解后，再加蒸馏水至 100 mL。 A.5 接触酶 A.5.1 成份 3 % 过氧化氢溶液。 A.5.2 制法 挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加 3 % 过氧化氢溶液 2 mL，观察结果。 A.6 氧化酶 A.6.1 成份 A.6.1.1 1 % 盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制，干冰箱内避光保存。 A.6.1.2 1 % - 萘酚 - 乙醇溶液。 A.6.2 制法 取白色洁净滤纸沾取菌落，加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深； 以正式出版文本为准 9 SN/T 4624.18 2021 再加 - 萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色，阴性于两

24、分钟内不变色。 以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。 A.7 糖发酵管（葡萄糖、木糖、L - 阿拉伯糖、甘露醇） A.7.1 成份 牛肉膏 5 g 蛋白胨 10 g 氯化钠 3 g 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 12H 2 O) 2 g 0.2 % 溴麝香草酚蓝溶液 12 mL 蒸馏水 1 000 mL pH 值 7.4 A.7.2 制法 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节 pH 值至 7.40.2。按 0.5 % 加入葡萄糖，分装于有一个 倒置小管的小试管内，121 高压灭菌 15 min。 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶 100 mL，121 高

25、压灭菌 15 min。另将各种糖 类分别配好 10 % 溶液，同时高压灭菌。将 5 mL 糖溶液加入于 100 mL 培养基内，以无菌操作分装小 试管。 注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。 A.7.3 试验方法 从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于 36 1 培养，一般观察 2 d3 d。迟缓反应需观察 14 d30 d。 A.8 硝酸盐还原 A.8.1 成份 硝酸钾 0.2 g 蛋白胨 5 g 蒸馏水 1 000 mL pH 值 7.4 A.8.2 制法 溶液，校正 pH 值，分装试管，每管约 5 mL，121 高压灭菌 15 min。 A.8.3 硝酸盐还原剂 A.8.3.

26、1 甲液：将对氨基苯磺酸 0.8 g 溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL 中。 A.8.3.2 乙液：将甲萘胺 0.5 g 溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL 中。 A.8.4 试验方法 接种后在 36 1 培养 1 d4 d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐 时立刻或于数分钟内显红色。 注： 本试验阴性的原因有三：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生 以正式出版文本为准 10 SN/T 4624.18 2021 长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。

27、A.9 7% NaCl 生长 A.9.1 成份 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化钠 70 g 蒸馏水 1 000 mL A.9.2 制法 将上述成分加热溶解，调节 pH 值至 7.40.2，分装，每瓶 225 mL，121 高压灭菌 15 min。 A.10 淀粉水解试验 A.10.1 成分 蛋白胨 5 g 牛肉膏 3 g 氯化钠 5 g 可溶性淀粉 20 g 琼脂 15 g 蒸馏水 1000 mL pH 值 7.4 A.10.2 制法 用少量水先将可溶性淀粉溶解，其他成分溶化在蒸馏水中，校正 pH 值。115 高压灭菌 15 min。 A.10.3 试验方法 将细菌划线接种于可

28、溶性淀粉琼脂平板上，在 37 培养 24 h。取出平板，在菌落处滴加碘液少 许，观察。培养基呈深蓝色，说明淀粉未被水解，即淀粉酶阴性。能水解淀粉的细菌其菌落周围有透 明的环 ( 即淀粉酶阳性 )。 A.11 明胶 A.11.1 成分 牛肉浸膏 3 g 蛋白胨 5 g 明胶 120 g 蒸馏水 1 000 mL pH 值 7.0 A.11.2 制法 将前两种成分加热溶化到蒸馏水中，校正 pH 值。在 50 55 缓慢加入明胶，边加边搅动， 分装试管，每管 5 mL，115 高压灭菌 15 min，制成高层。 以正式出版文本为准 11 SN/T 4624.18 2021 A.11.3 试验方法 挑

29、取 18 h 24 h 待试菌培养物，大量穿刺接种明胶高层，36 培养 7 d14 d，每天观察结果，看 是否液化，液化的为试验阳性。 A.12 TE 缓冲液（pH 值 8.0） A.12.1 成份 Tris 碱 1.21 g Na 2 EDTA2H 2 O 1.86 g 去离子水 1 000 mL A.12.2 制法 在 800 mL 去离子水中，依次加入以上成分，调节 pH 值至 8.0，用去离子水定容到 1 L，分装 后 121 高压灭菌 15 min。 A.13 1%3% 琼脂糖凝胶 A.13.1 成份 琼脂糖 13 g 0.5TBE 100 mL A.13.2 制法 在 100 mL

30、 的 0.5TBE 中，加入琼脂糖，在微波炉中加热熔化。待溶液冷却至 60 左右，灌注 模具冷却形成。 A.14 25 mM EDTA A.14.1 成份 Na 2 EDTA2H 2 O 46.525 g 去离子水 1 000 mL A.14.2 制法 在 800 mL 去离子水中，加入 Na 2 EDTA2H 2 O，充分搅拌，用 NaOH 调节 pH 值至 8.0，加去离子 水定容到 1 L，分装后 121 高压灭菌 15 min。 A.15 3M 醋酸钠 A.15.1 成份 NaAC3H 2 O 40.8 g 去离子水 100 mL A.15.2 制法 在 40 mL 去离子水中，加入

31、NaAC3H 2 O，充分搅拌，用冰醋酸调节 pH 值至 5.2，加去离子水定 以正式出版文本为准 12 SN/T 4624.18 2021 容到 100 mL，分装后 121 高压灭菌 15 min。 A.16 TBE A.16.1 成分 Tris 54.0 g 硼酸 27.5 g 去离子水 800 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 20 mL A.16.2 制法 54.0 g Tris，27.5 g 硼酸，800 mL 去离子水溶解，20 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）定容至 1 L。 以正式出版文本为准 13 SN/T 4624.18 2021 附

32、录 B （资料性） 短短芽孢杆菌基因序列（GenBank AF424046.1） 1 cgtgagaatg cgtaccaaaa agctgttctg acttacaacc tggctgttgt agcgtttgaa 61 actgcactgg gtaactagcc aaaaaacaag atttgtaagc ttttgaatca aattggaaaa 121 aggttcagtc gtgacagccc gccctgtgta ccctataata cgattgtggc ggatgtcact 181 tcgtacataa ttgacaggtg aataacgaac cacgaaaaaa actt

33、taattt tttttcgaag 241 gcgccgcaac ttttgattcg ctcaggcgtt taataggatg tcacacgaaa aacggggaat 301 tgtgtaaaaa agattcacga attctagcag ttgtgttaca ctagtgattg ttgcatttta 361 cacaatactg aatatactag agatttttaa cacaaaaagc gaggctttcc tgcgaaagga 421 ggtgacacgc gcttgcagga ttcgggcttt aaaaagaaag atagattaac aacaaatatt 48

34、1 ccccaagaac aatttgttta tactagagga ggagaacaca aggttatgaa aaaggtcgtt 541 aacagtgtat tggctagtgc actcgcactt actgttgctc ccatggcttt cgctg 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1.25 字数 39 千字 2021 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷 印数 1500 书号：155175326 定价 22.00 元 入境环保用微生物菌剂检测方法 第 18 部分：短短芽孢杆菌 行 业 标 准 SN/T 4624.182021 * * * SN/T 4624.18 2021 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7531 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址