GA T 1913-2021 法庭科学 生物检材中钩吻素甲和钩吻素子检验 液相色谱-质谱法.pdf

1、 ICS 13.310 CCS A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材 中钩吻素 甲和钩吻 素子检验 液相色谱- 质谱法 Forensic sciences Examination methods for gelsemine and koumine in biological samples LC-MS - 发布 - - 实施 中华人民 共和国 公安部 发 布 GA/T I 前 言 本文件 按 照 GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第 1 部分： 标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规定 起草。 请注意 本

2、文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。 本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任 。 本文件 由全 国刑 事技 术标 准化技 术委 员会 毒物 分析 分技术 委员 会 （SAC/TC 179/SC 1 ） 提 出并归 口 。 本文件 起草 单位 ： 公 安部 物证鉴 定中 心、 济南 市公 安局刑 事科 学技 术研 究所 、 云南 省公 安厅 、 柳州 市公安 局物 证鉴 定所 。 本文件 主要 起草 人： 栾玉 静、王 芳琳 、 王 爱华 、 武 继锋、 宋蕊 、李 虹 、 臧源 云、李 军 。 GA/T 1 法庭科学 生 物检 材中 钩吻 素甲和 钩吻素子 检验 液相 色谱-

3、质谱 法 1 范围 本文件 规定 了 法 庭科 学领域 生物 检材 （血、 尿、 肝 、 肾、 胃 及胃 内容） 中钩 吻素甲 和钩 吻素 子的 液 相色谱- 质谱 （LC-MS ）检 验方法 。 本文件 适用 于 法 庭科 学领域 生物 检材 （血、 尿、 肝 、 肾、 胃 及胃 内容） 中 钩 吻素甲 和钩 吻素 子的定 性分析 和定量 分 析。 其他 检材可 参照 使用 。 2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期

4、的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用于 本 文件。 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 毒 物分 析名词 术 语 3 术 语和 定义 界 定的 术语和 定 义适用 于本 文件 。 4 原理 以空白 样品 和添 加样 品作 对照， 按平 行操 作的 要求 ， 对生 物检 材进 行 提 取、 净化及 浓缩 ， 采 用液 相 色谱-质 谱法 检测， 以保 留 时间、 质谱特 征 离 子对 和 离子对 丰度比 作为 定性判 断依据 ； 以色谱 峰 面积 作 为定量 依据 ，采 用外 标- 单点 法进 行定 量分 析。 5 试 剂、 仪器 与材 料 5.1 试剂

5、 实验用 水应 符合 中规 定的 一级 水。 除 非另 有说明 ， 在 分析 中使 用的 试剂均 为 色 谱纯，试 剂包括 ： a) 甲醇； b) 乙腈； c) 甲酸铵 ； d) 甲酸； e) 乙酸乙 酯 ； f) 1% 氢氧 化钠 溶液 ： 称 称 氢 氧化 钠 1.0g ，加 入一 定量 的水溶 解并 稀释 至 100 ； g) 磷酸盐 缓冲 液 （pH 值 6）： 称 取磷 酸二 氢钠 （ 分析 纯）8.34g 与 磷酸 氢二 钠 （ 分析纯 ）0.87g, ， 分别置 于 1000mL 容 量瓶 中，加 水溶 解， 并稀 释至 刻度； GA/T 2 h) 含 0.1% 甲酸 的 10m

6、moL/L 醋酸铵 溶液 ： 称 取醋 酸铵 0.384g ， 加入 一定 量的 水溶 解 ， 并加 入 0.5mL 甲酸混 匀， 加水 稀释 至 500mL ； i) 标准溶 液： 1） 单一 标准 物质 储 备液 ： 根据 钩吻 素甲 和钩 吻素子 标准 物质 的纯 度， 分别用 甲醇 配制 钩吻 素甲 和 钩吻素 子单一 标 准物 质 储 备液 ， 密封 ， 以 下保 存，有 效 期 12 个月 。或 采用 市售 单 一标准 溶液 ； 2） 0.1mg/mL 混合 标准 物 质工作 溶 液 ：移 取 1.0mg/mL 的 钩吻 素甲 和钩 吻素 子单一 标准 物质 储备液 ， 用甲 醇配

7、制 成浓 度为 0.1mg/mL 的混合 标准物质工作 溶 液 ， 密封 ， 0 4 保 存， 有效 期 3 个 月。 实验 中所 用其 他 浓度 的混 合标 准物质 工作 溶液均由 0.1mg/mL 混合标 准 物 质工作 溶液 用甲 醇稀 释得 到； 3） 10.0 g/mL 单一 标准 物质 工作溶 液 ： 移取 1.0mg/mL 的钩 吻素 甲和 钩吻 素子 标准物 质储备 液，分别 用 甲醇 配制 成 1.0 g/mL 单 一标 准物 质工 作 溶液， 密封 ，0 4 保存 ，有效 期 3 个月。 实验 中所 用其 他浓 度的单 一标 准物质 工 作溶 液均 由 10.0 g/mL

8、单一 标 准物质 工作 溶 液用甲 醇稀 释得 到。 5.2 材料 材料包 括： a ） 具盖离 心管 ； b） 具塞玻 璃试 管 ； c ） 固 相萃 取柱 ：Oasis HLB 固相 萃取 柱 或 等效 固相 萃取柱 ； 注： 柱是 公司产品的商品名称， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 d） 一次性 注射 器 ； e ） 有 机系 微孔 滤膜 ：0.22 m 。 6 仪 器和 设备 仪器和 设备 包括 ： a) 液相色 谱 质 谱仪 ，配 有电 喷雾离 子源 （ ） 和三 重 四极杆 质量 分析 器

9、； b) 电子天 平： 实际 分度 值 d ； c) 离心机 ； d) 振荡器； e) 移液器 ； f) 浓缩器 。 7 操 作方 法 7.1 定性 分析 7.1.1 样品 前 处理 7.1.1.1 液 液萃 取 移取血 液等 液体 检材 样 品 1.0mL ，或 称取 铰碎 的肝 脏 等固体 检材 样 品 1.0g 于 具 盖离心 管中 ，加 入 一定量 的氢 氧化 钠溶 液 调 pH 值 （910 ） ， 再加入 5mL 乙 酸乙 酯， 振 荡 10min ， 不 低于 8000r/min 离心GA/T 3 10min ， 分 离有 机相 ， 重 复 提取一 次， 合并 两次 提取 的 有

10、机 相， 置于 浓缩 器上 浓 缩至 干， 残留 物用 甲醇 0.1mL 溶解 ， 经 的有 机系 微孔 滤膜过 滤 ，作为 检材 样品 提取 液， 供仪器 检测 。 注：检材样品取样量、提取溶剂体积及定容体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2 固相 萃取 移取血 液等 液体 检材 样品1.0mL ， 或称 取铰 碎的 肝脏 等固体 检材 样品1.0g 于具 盖离心 管中 ， 加入pH 值6磷酸 盐 缓冲 液3mL，混 匀， 超 声15min ， 不低 于8000r/min 离心20min ， 取上 清 液 转移 至固 相萃 取柱 中 （使用 前依 次用 甲醇3mL、水 3mL 活化 ） ，

11、 控 制上 清液 过柱流 速0.5mL/min 1.0mL/min ， 再 依次 用水3mL 、 甲醇/水（ 体 积比5:95 ）3mL 淋 洗， 抽 干弃 去淋 洗液 ， 挤干水 分或 离心 或真 空抽 固相萃 取柱2min ， 用 甲醇 2mL 洗 脱 ， 收 集洗 脱液 并 置于浓 缩器 上 浓 缩至 干， 残留 物用500 L 初始 流 动相溶 解 ， 经 的有 机系微 孔滤 膜过 滤， 作为 检材样 品提 取液 ，供 仪器 分析。 注：检材样品取样量、缓冲液体积、洗脱液体积及定容体积可根据实际情况调整。 7.1.1.3 质控 样品 制备 取等量 相似 基质 的空 白样 品 （ 若无

12、相似 基质 空白 样 品可用 血液 替代 ） 两份 于 具盖离 心管 中 ， 一 份作 为空白 样品 ， 一 份添 加 钩 吻素甲 和钩 吻素 子 标 准物 质， 使其浓 度为20ng/mL （g） ， 作为 添加 样品 ， 与检 材样品 平行 操作 ，得 到空 白样品 提取 液和 添加 样品 提取液 ，供 仪器 分析 。 7.1.2 仪 器检 测 7.1.2.1 液相 色谱- 质谱 仪条件 以下为 参考 条件 ，可 根据 不同品 牌仪 器和 不同 样品 等实际 情况 进行 调整 ： a) 色谱柱 ：Kinetex C 18 （3.0mm 50mm ，2.6 m ）柱 或 等效色 谱柱 ； 注

13、： Kinetex C18 柱为 Phenomenex 公司产品的商品名称， 给出 这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不是表示对 该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。 b) 流动相 ：A ： 含 0.1%甲酸的 10mmoL/L 甲酸 铵溶 液 ，B ：甲 醇； c) 流速：0.5mL/min ； d) 洗脱方 式： 梯度 洗脱 ，梯 度见 表 1； 表1 梯 度洗 脱条 件 时间 流动相 流动相 e) 进样量 ：1L 10L ； f) 扫描方 式： 正离 子扫 描 （ESI + ） ； g) 检测方 式： 多反 应监 测 （MRM ） ； h) 电喷雾

14、电压 ：5500V ； GA/T 4 i) 离子源 温度 ： ； j) 雾化气 压力 ：55psi ； k) 气帘气 压力 ：50psi ； l) 辅助气 压力 ：50psi ； m) 定性定 量 离 子对 、去 簇电 压、碰 撞能 量见表 2 。 表2 定性 定量 离子 对、 去簇电 压、 碰撞 能量 目标物 定量离子对 定性离子对 去簇电压 碰撞能量 钩吻素甲 钩吻素子 7.1.2.2 进样 分别吸 取空 白溶 剂、 添加 样品提 取液 、空 白样 品提 取液、 检材 样品 提取 液、 混合 标准物 质工作 溶液 ， 按 仪 器条件 进样 检测 。进 样顺 序和进 样次 数应 确保 结果

15、有效 。 7.2 定量 分析 7.2.1 样品 前 处理 移取血液等液体检材样品1.0mL 两份，或称取铰碎的 肝脏等固体检材样品1.0g两份，按7.1.1进行操 作，得到 检材 样 品提 取液 ，供仪 器检 测 。 取与检 材样 品等 量的 相似 基质空 白样 品， 按7.1.1 进 行操作 ，得 到空 白样 品提 取液， 供仪 器检 测。 取与检 材样 品等 量的 相似 基质空 白样 品两 份， 添加 混合标 准物 质工 作溶 液， 作为添 加样 品， 按7.1.1 进 行 操作 ， 得到 添 加样 品提 取 液， 供 仪器 检 测。 检材 样 品中 目 标物 含 量应 为 添加样品 中

16、目标 物 含量 的 （100 50 ）% 范 围内 。 7.2.2 仪 器检 测 7.2.2.1 仪器 条件 按 条件 分析 。 7.2.2.2 进样 分别吸 取检 材样 品提 取液 、空白 样品 提取 液、 添加 样品提 取液 ， 按 仪 器条件 进样 分析 。每 份检材 样品 提取 液和 添加 样品提 取液 各进 样分 析 次 。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算 含量 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物的 保留时 间和 峰面 积值 ，按 公式（1） 计算 检材 样 品中目 标物 的含 量。 = A A . （1 ） 式中： GA/T 5 检 材样 品中 目

17、标 物的 含量； A 检材 样品 提取液 中目 标 物的峰 面积 的平 均值 ； A 添 加样 品 提 取液 中目 标物的 峰面 积 的 平均 值 ； 添 加样 品中 目标 物的 含量。 7.2.3.2 计算 相对 相差 记录7.2.3.1 中计 算得 到的 检材样 品中 目标 物的 含量 ，按公 式 （2） 计算 相对 相 差： 12 100% - RD = . （2 ） 式中： RD 相 对相 差， 用百 分比 （ ） 表示 ； 、 两份 检材 样品 中 目标物 的含 量； 两份 检材 样品 中目 标物 含量的 平均 值 。 8 结 果评 价 8.1 定性 结果 评价 8.1.1 阳 性结

18、 果评 价 在相同 条件 下进 行样 品测 定时， 检材 样品 中目 标物 的色谱 峰保 留时 间与 标准 物质工 作溶 液 一 致 （ 相 对误差在 之 内） 、 目 标物的 两对 定 性 离子 与 标 准物质 工作 溶液 一致， 且 离子 对 丰度 比与 浓度 接近 的 标准物 质工 作溶 液 相 比 ， 相对偏 差不 超过 表 规定 的范围 ， 空白 样品 无干 扰 ， 则 可判 断检 材样 品中 检 出 目标物 。钩 吻素 甲和 钩吻 素子 的 谱图 参 见附 录 。 表3 离子 对丰 度比 的最 大允许 相对 偏差 范围 离子对丰度比 50% 20% 50% 10% 20% 最大允许

19、相对偏差 20% 25% 30% 50% 8.1.2 阴 性结 果评 价 检 材 样 品未 出 现与 目 标物标 准 物 质工 作 溶液 一 致的色 谱 峰 ，且 添 加样 品 中出现 与 目 标物 标 准 物质 工作溶 液一 致的 色谱 峰， 空白样 品无 干扰 ，则 可判 断检材 样品 中未 检出 目标 物。 8.2 定量 结果 评价 检材样 品中 目标 物含 量的RD 20% ， 定 量数 据可靠 ， 其含量 按两 份检 材的 平均 值计算 。 检材 样品 中 目标物 含量 的RD 20% ， 定量数 据不 可靠 ，应 按7.2 重新提 取检 验 。 钩吻素 甲和 钩吻 素子 的检 出限

20、参 见附 录 ， 相关 参 考资料 参见 附 录 。 GA/T 6 附 录 A （资料 性） 钩吻素 甲和 钩吻 素子 的相 关谱图 和检 出限 A.1 相关 谱图 钩吻素 甲和 钩吻 素 子 LC-MS/MS 谱 图见图 A.1 和图 A.2 。 图A.1 钩 吻素 甲 LC-MS/MS 谱图 图A.2 钩 吻素 子 LC-MS/MS 谱图 A.2 检出 限 本 方法 钩吻 素甲 和钩 吻素 子的检 出限 均为1ng/mL 或1ng/g 。 GA/T 7 附 录 B （资料 性） 钩吻素 甲和 钩吻 素子 的相 关资料 B.1 钩吻 素甲 和钩 吻素 子 的相关 资料 钩吻, 又名 大茶 药

21、、 断 肠草等, 是 马钱 科胡 蔓藤 属的全 草， 产于 浙江 、福 建、广 东、 广西 、贵 州、 云南等 地。 钩吻 全株 有毒 ， 根、 茎、 叶均 含有 生物 碱， 以 根部 含量 最高， 根 皮最高 ， 该 类植 物因 毒性 极 强， 多 用于 外用 ， 应 用不 当或误 服可 致中 毒， 有时 还可致 命。 国内 钩吻 主要 毒性成 分是 钩吻 碱， 有从 钩 吻中可 以分 离出 钩吻 素子 、钩 吻素 甲 、钩吻 素寅 、钩 吻素 卯 、 钩吻 素 辰 、钩 吻素 丙 、 钩吻 素丁 和钩 吻 素戊 等 生物 碱。 因产 地不 同所 含的 生 物碱的 种类 和含 量也 略有 差

22、异 ， 广 东产 的钩 吻根 中 曾 分离得 到钩吻 素子 、卯、 丁和戊 ；而福 建产 的分离 到了钩 吻素甲 、丁 、子、 卯、戊 、己等 生物 碱。 其 中钩吻 素子 含量 最高 。 国 外钩吻 所含 化学 成分 与国 内的钩 吻存 在差 异。 如北 美产钩 吻除 与国 内钩 吻某 些 相同的 化学 成分 外含 量相 差很大 ，以 钩吻 素甲 为主 要成分 含量 最高 。 钩吻中 毒主 要抑 制延 髓呼 吸中枢 ， 并抑 制脑 和脊 髓 的运动 中枢 。 临床 表现 以 呼吸系 统 、 神 经系 统症 状为主 ，可 出现 呼吸 衰竭 和呼吸 肌麻 痹， 是钩 吻中 毒最常 见的 死因 。 钩吻素 甲 ， 分子 式为 ， 号为 ， 小鼠 为 ， 神经 性痉 挛毒 物 ， 对心脏也有 作用 ，大剂量时有降压作 用 而小剂量 时却降低迷走 神经的张力 ， 并产生心动 过速 。结构式 图见 图 。 钩 吻素 子 分子 式为 ， 号为 ， 小鼠 为 。 结 构式 图见 图 。 图B.1 钩 吻素 甲结 构式 图B.2 钩 吻素 子结 构式