DB32 T 3762.17-2021 新型冠状病毒检测技术规范 第17部分：核酸检测用假病毒阳性质控品.pdf

1、ICS 13.100 C 50 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.172021 新型冠状 病毒检测 技术规范 第 17 部分 ：核酸检 测用假病 毒阳性质 控品 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 17: Pseudovirus positive control material for nucleic acid detection 2021- 12 - 09 发布 2022 - 01 - 09 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 3762.172021 I 目 次

2、 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规 范性 引用 文件 . 1 3 术 语和 定义 . 1 4 缩 略语 . 2 5 技 术要 求 . 2 6 试 剂和 材料 . 3 7 仪 器和 设备 . 3 8 假 病毒 原液 的技 术要 求 . 3 9 质 控品 的制 备 . 5 10 质 控品 的技 术要 求 . 5 DB32/T 3762.172021 II 前 言 DB32/T 3762 新 型冠 状病 毒检测 技术 规范 目 前分 为以下 部分 ： 第1部 分： 生物 样本 采 集、运 输和 保存 ； 第2部 分： 病毒 分离 与 鉴定； 第3部 分： 核酸 荧光PCR 检测 程序 ；

3、第4部 分： 重组 酶介 导 等温扩 增程 序； 第5部 分： 血清IgM 和IgG 抗体 酶联 免疫 吸附检 测 程序； 第6部 分： 血清IgM 和IgG 抗体 胶体 金免 疫层析 检 测程序 ； 第7部 分： 空气 样本 检 测与评 估； 第8部 分： 物体 表面 检 测与评 估； 第9部 分： 医务 人员 职 业暴露 检测 与评 估； 第10部 分： 微量 血清 中和试 验； 第11部 分： 全基 因组 高通量 测序 ； 第12部 分： 药物 体外 抗病毒 效果 测定 ； 第13部 分： 叠氮 溴化 丙锭- 荧光PCR 检测 程序 ； 第14部 分：N 亚基 因 组荧光PCR 检测 程

4、序 ； 第15部 分： 血清/ 血浆IgM 和IgG 抗 体磁 微粒 化学 发光法 检测 程序 ； 第16部 分： 核酸 数字PCR 法； 第17部 分： 核酸 检测 用假病 毒阳 性质 控品 ； 第18部 分： 规模 化核 酸检测 程序 。 本 文件 为DB32/T 3762 的第17部 分。 本 文件 按照GB/T 1.1-2020 标准 化工 作导 则 第1 部 分： 标 准化 文件 的结 构和 起草规 则 的规 定 起 草。 本 文件 由江 苏省 卫生 健康 委员会 提出 。 本 文件 由江 苏省 卫生 标准 化技术 委员 会归 口。 本 文件 起草 单位 ： 南 京市 计量监 督检

5、测院 、江 苏省 疾病预 防控 制中 心 、 苏州 市疾病 预防 控 制 中 心 。 本 文件 主要 起草 人： 林婧 、 朱立 国 、 林学 勇 、 胡宁 、 胡啟 龙 、 王尚 君 、 范宇 宸 、 朱文 、 张雨 晨 、 洪 捷、 谈 忠鸣 、夏 瑜、 樊欢 、邓斐 。DB32/T 3762.172021 1 新型冠状 病毒 检 测 技术规范 第 17 部 分：核酸 检测用 假 病毒阳性 质控品 1 范围 本文件 规定 了 新 型冠 状病 毒 核酸 检测 用假 病毒 类弱 阳性质 控品 的术 语和 定义 、 缩略语 、 试 剂和 材料 、 仪器和 设备 、假 病毒 原液 的技术 要求 、

6、质 控品 的制 备和质 控品 的技 术 要 求。 本 文件 适用 于新 型冠 状病 毒 核酸 检测 用假 病毒 类弱 阳性质 控品 的技 术要 求以 及评价 方法 。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本 文件。 GB/T 6682 分析 实验室 用 水规格 和试 验方 法 JJF 1006 一 级标 准物 质技 术规范 JJF 1343

7、标准 物质定 值 的通用原 则及统 计学原 理 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。 3.1 质控品 control material 用于体 外诊 断的 质量 控制 物质 ， 是 一种 旨在 用于 医 学用途 的检 测系 统中 使用 的物质 、 材料 、 物品 或 设备 ， 其 目的 是评 价或 验 证测量 精密 度 、 测 量准 确 度、 由于 试剂 或分 析仪 器 的变化 检测 系统 可能 产生 的 分析偏 差等 性能 特征 ，可 用于能 力验 证、 实验 室内 质量控 制。 3.2 假病毒 pseudovirus 一种具 有病 毒拟 似的 物理 结构和 特异 性核

8、酸序 列的 病毒样 粒子 ， 其 分析 特性 与真实 病毒 相似 ， 但 不 具备自 我复 制和 感染 的能 力。 3.3 假病毒 质控 品 pseudovirus control material 由假病 毒原 料定 量分 装后 制成， 能够 参与 到 病 毒检 测从提 取到 扩增 的全 过程 ； 具有 生物 安全 性 的 同 时可作 为测 量标 准， 用于 病毒核 酸定 性和 定量 测量 方法的 验证 评价 以及 实验 室的质 量控 制。 3.4 计量溯 源性 metrological traceability DB32/T 3762.172021 2 通过一 条具 有规 定不 确定 度的

9、不 间断 的比 较链 ， 使 测 量结果 或测 量标 准的 值能 够与规 定的 参考 标 准 （通常 是与 国家 测量 标准 或国际 测量 标准 ）联 系起 来的特 性。 3.5 同源性 homology 两个核 酸分 子的 核苷 酸 序 列间的 相似 程度 。 本 文指 假 病毒质 控品 中目 的基 因序 列与相 应的 真实 病 毒 参考毒 株序 列的 一致 性。 3.6 均匀性 uniformity 同一批 次生 产的 假病 毒质 控品， 每个 最小 包装 单元 含有等 量 的 目标 假病 毒 的 状态。 通过 测量 取 自 不 同包装 单元 或取 自同 一包 装单元 的 、 特 定量 的

10、样 品 ， 定量测 量结 果落 在规 定不 确定度 范围 内 ， 则 可认 为 质控品 所含 目标 假病 毒的 量是均 匀的 。 3.7 稳定性 stability 假病毒 质控 品在 特定 的保 存条件 和保 存时 间内 ，假 病毒的 量保 持在 规定 范围 内的能 力。 4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件 。 DMEM ：Dulbecco 改良 培 养基（Dulbeccos modified eagles medium ） PCR ： 聚合 酶链 式反 应（polymerase chain reaction ） qPCR ：荧 光定 量聚 合酶 链式反 应（quantitative

11、 polymerase chain reaction ） RT-PCR ： 逆转 录聚 合酶 链式反 应（reverse transcription polymerase chain reaction ） RT-qPCR ： 逆 转 录 荧光定量聚合酶链式反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction ） RNase ： 核糖 核酸 酶（ribonuclease ） 5 技术要 求 5.1 假病毒 质控 品的 技术 要求 主要分 为两 个方 面， 包含 对假病 毒原 液的 技术 要求 ，如 假 病毒 内靶 标 RN

12、A 序列 的同 源性 、 假 病 毒原液 的杂 质残 留等 ； 还 包含对 质控 品成 品的 技术 要求， 如靶 标 RNA 定 值、 均匀性 、稳 定性 等。 5.2 假病毒 质控 品必 须同 时满 足以下 8 点技 术要 求， 才 能作为 新型 冠状 病毒 核酸 检测用 的弱 阳性 质 控 品： a) 用于制 备质 控品 的原 料假 病毒含 有与 新冠 核酸 检测 的靶标 RNA 序列 一致 的 RNA ； b) 用于制 备质 控品 的假 病毒 原液 不 含有 cDNA 杂 质； c) 用于制 备质 控品 的假 病毒 原液无 菌； d) 质控品 的靶 标 RNA 浓 度 为试剂 盒检 出限

13、 的 1.5-3 倍左右 ，且 定值 结果 具有 计量溯 源性 ； DB32/T 3762.172021 3 e) 质控品 同批 次均 匀性 合格 ； f) 质控品 短期 、长 期及 极端 环境下 稳定 性合 格； g) 质控品 适用 于至 少 8 款 获 批上市 的新 型冠 状病 毒核 酸检测 试剂 盒。 6 试剂 和 材料 6.1 无酶水 ：GB/T 6682 中 的 一级水 ，应 为无 RNA 酶 的水。 6.2 PCR 、RT-PCR 、RT-qPCR 、 数字 PCR 相关 试 剂：商 品化 试剂 。 6.3 PCR 引 物、 探针 ：参 照权 威机构 公布 的序 列或 自行 设计。

14、 6.4 RNase ： 商品 化试 剂。 6.5 无 RNA 酶的 各型 号枪 头 、EP 管、PCR 管、 离心 管、试 管： 商品 化耗 材。 6.6 本文件 中所 有的 化学 试剂 ，除特 别说 明外 ，全 部为 分析纯 级别 试剂 。 7 仪器和 设备 7.1 生物安 全柜 。 7.2 普通离 心机 、冷 冻离 心机 。 7.3 恒温水 浴锅 。 7.4 PCR 仪。 7.5 核酸电 泳仪 。 7.6 凝胶成 像系 统。 7.7 荧光定 量 PCR 仪。 7.8 数字 PCR 系 统。 7.9 各型号 移液 器。 7.10 培养箱 。 8 假病毒 原液 的技 术要 求 8.1 靶标

15、RNA 序列 同源 性的检测 8.1.1 检测方 法 8.1.1.1 RT-PCR 检测 提取假 病毒 的 RNA 作 为 模板 。 选用 中国 疾病 预防 控制中 心或 世界 卫生 组织 推荐的 （见 表 1） 或根 据靶标 RNA 自 行设计 的 引物进行 RT-PCR 扩 增。 设置以 水为 模板的 阴性 对 照， 以 含靶 标 RNA 的标 准物质 为模 板的 阳性 对照 。 扩增 产物 经电泳 分 离、 回收 反 应产 物。 DB32/T 3762.172021 4 表1 中国疾 病预 防控 制中 心、 世界卫 生组 织 推 荐的 新型 冠状病 毒核 酸检 测引 物和 探针序 列 目

16、标基因 引物/ 探针序列（53 ） ORF1ab F CCCTGTGGGTTTTACACTTAA R ACGATTGTGCATCAGCTGA P 5-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3 N F GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT R CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG P 5-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3 E F ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT R ATATTGCAGCAGTACGCACACA P 5-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ-3

17、 8.1.1.2 测序及 溯源 性分 析 将 8.1.1.1 的 产 物 测 序 。 测 序 结 果 与 相 应 的 新 型 冠 状 病 毒 核 酸 检 测 靶 标 RNA 的 参 考 序 列 进 行 比 对。 8.1.2 结果判定 在 RT-PCR 阴 性对 照和 阳 性对照 都成 立的 情况 下 ： a) 若满足 假病 毒 RNA 的 RT-PCR 产物 的电 泳结 果为 阳性且 测序 结果 比对 一致 ，则为 合格 ； b) 若假病 毒 RNA RT-PCR 产物的 电泳 结果 为阴 性， 则表明 假病 毒未 包裹 病毒 RNA ， 或 假病 毒 核酸提 取失 败， 应重 新制 备假病

18、毒或 提取 核酸 。 8.2 cDNA 杂质 的检 测 8.2.1 检测方 法 分 别 以未 做核 酸 提取 的假病 毒 原液和 假 病 毒中 提取 的 RNA 为模 板， 使 用推荐 的 或自 行设 计 的 引 物和探针或商品化 试剂盒 进行 qPCR 扩增 。设置以 水为模板的阴性对 照，以 重组质粒为模板的 阳性对 照。 8.2.2 结果判 定 在阴性 对照 和阳 性对 照都 成立的 情况 下 ： a) 若未提取的假病毒原液和/ 或假病毒提取的 RNA 的 qPCR 结果为阳性，即出 现典型的 S 型 扩增曲 线或 依据 试剂 盒说 明书判 定， 则表 明原 液中 或假病 毒内 含有 c

19、DNA 杂 质， 即 为不 合格 ， 应重新 消化 去除 cDNA 杂 质。 b) 若未提 取的假 病毒 原液和 假病毒 提取的 RNA 的 qPCR 结果 为阴性 ，即 未起 峰或依 据试剂 盒 说明书 判定 ，说 明无 cDNA ，即 为合 格。 8.3 无菌检 测 用 DMEM 培 养基 37 培养假 病毒 原液 24 h ， 溶 液澄清 ，无 菌生 长， 即为 合格。 9 质控品 的制 备 DB32/T 3762.172021 5 对结果 判定 为合 格的 假病 毒原液 ， 根 据需 要使 用适 当的溶 剂对 假病 毒原 料进 行稀释 后， 分装 至 冻 存 管，直 接或 冻干 后 -

20、20 保存。 具体 制备 过程 本文 件不作 赘述 。 10 质控品 的技 术要 求 10.1 新型冠 状病 毒靶 标 RNA 的 定量 10.1.1 基本要 求 采用核酸提取方法提取假病毒质控品的 RNA ， 采 用 RT-qPCR 法或数字 PCR 法 对 靶 标 RNA 的浓度 进行 定值 。 使 用推 荐的 或 自行 设计 的引物 和 探针或 商品 化试 剂盒 进行 定值。 核酸 提取 方 法 和 靶 标 RNA 浓度 的定 值方 法均 应 通过适 宜的 国家 有证 标准 物质的 验证 方可 采用 。 10.1.2 RT-qPCR 定 量法 10.1.2.1 使用 RT-qPCR 法进

21、 行定 量时， 所使 用的 具体 方法 应为针 对新 型冠 状病 毒靶 标 RNA 片段 设计建 立的 方法 。 10.1.2.2 标准品 可以 为拷 贝数 已知 的新型 冠状 病毒 RNA 或 cDNA ， 或 含有 相关目 的 DNA 片段的 重组质 粒。 10.1.2.3 将标准 品以 10 倍进 行梯 度稀释 至少 5 个梯 度， 分 别以每 个梯 度的 标准 品溶 液作为 模板 ， 进行 RT-qPCR 反应 ，根 据各梯 度 标 准品 的 Ct 值 和浓度 制定 标准 曲线 和公 式。 10.1.2.4 根据质 控品 RNA 的 Ct 值， 利 用标 准曲 线和 公式 计算出 质控

22、 品中 新型 冠状 病毒靶 标 RNA 的浓度 。 10.1.3 数字 PCR 定量 法 10.1.3.1 使用数 字 PCR 法进 行定 量时 ， 所 使用 的具 体方 法 应 为针对 新型 冠状 病毒 靶标 RNA 片段 设 计建立 的方 法。 10.1.3.2 提取假 病毒 RNA ，上 样 至数 字 PCR 反应 体系 ，进 行数 字 PCR 反应 。按 照式 （1） 计算 质 控品 RNA 的 浓度 。 B A C C 1 （1 ） C 质控 品中 靶标 RNA 的原始 浓度 ，单 位为 拷贝 每微升 ； C 1 数字 PCR 检测 结果 所示的 靶标 RNA 的浓 度 ，单位 为拷

23、 贝每 微升 ； A 数字 PCR 反应 体系 中 靶标 RNA 的 稀释 倍数 ； B 核酸 提取 时 靶标 RNA 的浓 缩倍 数。 10.1.4 靶标 RNA 浓度 的计 算 定 值 结果 采取 10.1.2 或 10.1.3 所 述的 方法 进行 靶 标 RNA 的浓 度计 算， 质 控品 浓 度为 新冠核酸 检测试 剂盒 检出 限的 1.5-3 倍左 右即 为合 格 。 10.2 均匀性 检测 10.2.1 检测方 法 DB32/T 3762.172021 6 按照JJF 1006 和JJF 1343 的要求 ， 依据 每一 批次 质 控品的 制备 数量， 随机 抽 样选择 不同 数

24、量 的包 装 单元 进行 均匀 性检 测。对 质控 品进 行核 酸提 取后， 按 10.1.2 或 10.1.3 的方 法进 行靶标 RNA 浓度 测定， 计算 每一 个包 装单 元 靶标 RNA 的浓度 。 10.2.2 均匀性 判定 对所得 数据 按照 JJF 1006 和 JJF 1343 的统 计学 要 求进行 检验 ，若 结果 无显 著性差 异， 则质 控品 均匀性 良好 ，即 为合 格。 若存在 显著 性差 异， 即为 均匀性 不合 格 。 10.3 稳定性 检测 10.3.1 短期稳 定性 短期稳 定性 评价 质控 品在 使用温 度 （20 5 ） 和 运输 温度 4 下 的稳

25、定性 。 按 JJF 1006 和 JJF 1343 的方法 进行 评价 。按 10.1.2 或 10.1.3 的 方法 进行 靶 标 RNA 浓度 测定 。 10.3.2 长期稳 定性 长期稳 定性 评价 质控 品在 存储温 度 -20 的稳 定性 。 按 JJF 1006 和 JJF 1343 的方法 进行 评 价 。 按 10.1.2 或 10.1.3 的 方法 进 行靶标 RNA 浓度 测定 。 10.3.3 Rnase 耐受 性检 测 Rnase 耐受 性评 价质 控品 暴露于 极端 高浓 度 Rnase 环境下 的稳 定性 。 根据 Rnase 的使 用说 明书 进 行质控 品 的

26、 孵育 。孵 育后 的质控 品， 按 10.1.2 或 10.1.3 的方 法进 行靶 标 RNA 浓度 测定 。 10.3.4 稳定性 判定 10.3.4.1 对不同 时间 点或 Rnase 处 理前后 所得 质控 品靶 标 RNA 浓 度的 数据 按照 JJF 1006 和 JJF 1343 的统 计学 要求 进行 检 验。若 无显 著性 差异 ，说 明稳定 性良 好， 即为 合格 。若存 在显 著性 差异 ，说 明对应 条件 下稳 定性 不合 格。 10.3.4.2 质控品 在（20 5 ） 使用 温度下 应至 少稳 定 3 h ，在 4 运 输温 度下 至少 稳 定 1 个 月， 在 -20 存 储温 度下 至少 稳定 6 个 月，RNase 处理 1h 后 稳定 性应 符合 要求 。 10.4 适用性 验证 用获批 上市 的新 型冠 状病 毒核酸 检测 试剂 盒验 证质 控品的 适用 性。 按照 试剂 盒 说明进 行操 作和 结 果 判定， 结果为 阳性 即为适 用。质 控品适 用于 至少 8 款获批 上市的 新型 冠状病 毒核酸 检测试 剂盒 ，即 为 合格。 _