DB32 T 3762.14-2021 新型冠状病毒检测技术规范 第14部分：N亚基因组荧光PCR检测程序.pdf

1、 ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.142021 新型冠状病毒检 测技术规 范 第 14 部分 ： N 亚基因 组荧光 PCR 检测程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 14: Real-time fluorescence PCR test N subgenomic RNA procedure 2021 -12-09 发布 2022 -01-09 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 3762.142021 I 目 次 前 言 .

2、II 1 范围 . 1 2 规 范性 引用 文件 . 1 3 术 语和 定义 . 1 4 环 境与 设施 . 1 5 设 备与 耗材 . 1 6 试 剂与 材料 . 1 7 样 本前 处理 与核 酸提 取 . 2 8 扩 增体 系配 制与 扩增 . 2 9 结 果判 定 . 2 10 附录 A . 3 DB32/T 3762.142021 II 前 言 DB32/T 3762 新 型冠 状 病 毒检测 技术 规范 目 前分 为以下 部分 ： 第1部 分： 生物 样本 采 集、运 输和 保存 ； 第2部 分： 病毒 分离 与 鉴定； 第3部 分： 核酸 荧光PCR 检测 程序 ； 第4部 分：

3、重组 酶介 导 等温扩 增程 序； 第5部 分： 血清IgM 和IgG 抗体 酶联 免疫 吸附检 测 程序； 第6部 分： 血清IgM 和IgG 抗体 胶体 金免 疫层析 检 测程序 ； 第7部 分： 空气 样 本 检 测与评 估； 第8部 分： 物体 表面 检 测与评 估； 第9部 分： 医务 人员 职 业暴露 检测 与评 估。 第10部 分： 微量 血清 中和试 验； 第11部 分： 全基 因组 高通量 测序 ； 第12部 分： 药物 体外 抗病毒 效果 测定 ； 第13部 分： 叠氮 溴化 丙锭- 荧光PCR 检测 程序 ； 第14部 分：N 亚基 因 组荧光PCR 检测 程序 ； 第1

4、5部 分： 血清/ 血浆IgM 和IgG 抗 体磁 微粒 化学 发光法 检测 程序 ； 第16部 分： 核酸 数字PCR 法； 第17部 分： 核酸 检测 用假病 毒阳 性质 控品 ； 第18部 分： 规模 化核 酸检测 程序 。 本文件 为DB32/T 3762 的第14部 分。 本文件 按照GB/T 1.1-2020 标准 化工 作导 则 第1 部 分： 标 准化 文件 的结 构和 起草规 则 的规 定起 草。 本 文件 由江 苏省 卫生 健康 委员会 提出 。 本 文件 由江 苏省 卫生 标准 化技术 委员 会归 口。 本 文件 起草 单位 ： 江 苏省 疾 病预防 控制 中心 、 无

5、锡市 疾 病预防 控制 中心 、 镇 江市 疾 病预防 控制 中心 、 常州市 疾病 预防 控制 中心 。 本 文件 主要 起草 人 ： 朱 小 娟、 崔仑 标 、 朱 宝立 、 葛 以跃 、 吴 涛 、 吴 斌 、 赵 康 辰 、 乔乔 、 陈银 、 肖勇、 徐虹、 王凤 鸣 。 DB32/T 3762.142021 1 新型冠状 病毒检 测 技术规范 第 14 部 分：N 亚基因 组荧 光 PCR 检测程 序 1 范围 本 文件 规定 了新 型冠 状病 毒 N 亚 基因 组荧光 PCR 检测 环境 与设 施、 设备 与耗 材、 试剂与 材料 、 样 本前处 理与 核酸 提取 、扩 增体系

6、配制 与扩 增、 结果 判定。 本 文件 适用 于新 型冠 状病 毒 N 亚 基因 组荧光 PCR 检测 ， 为判 断样 本中 的新 型 冠状病 毒是 否具 有感 染性提 供辅 助手 段 。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改版 ） 适 用 于 本 文件。 DB32/T 3762.3 新 型冠 状 病毒检 测技 术规 范 第3部 分：核 酸荧 光PCR 检 测

7、程 序 3 术语和 定义 3.1 亚基因 组 RNA subgenomic RNA ，SgRNA 在结构 上由 病毒5UTR 区Leader 序 列及 各基 因转 录RNA 片 段构 成 ， 亚 基因 组的 出 现可反 应病 毒复 制 状态， 从而 代表 病毒 的感 染性。 4 环境与 设施 同 DB32/T 3762.3 的4.1 条 和4.2 条。 5 设备与 耗材 同 DB32/T 3762.3 的5.1 条 和5.2 条。 6 试剂 与 材料 6.1 试剂 6.1.1 病毒核 酸提 取试 剂盒 。 6.1.2 实时荧光 PCR 检 测试 剂。 6.2 引物 与 探针 DB32/T 37

8、62.142021 2 新 型冠状 病毒N 亚基因 组的荧 光定量 PCR 引物 、探针 组合物（ 序列 见附 录A ）， 其中探针 的5 端 标记的 是FAM 荧光 报告 基 团，3 端标 记的 是BHQ1 荧 光淬灭 基团 。 阴性 对照 为DEPC 水 、 阳 性对 照为含N 亚基因 组片 段的 质粒 （序 列见附 录A）。 6.3 材料 同 DB32/T 3762.3 的6.2 条 。 7 样本前 处理 与核 酸提 取 同 DB32/T 3762.3-2020 的7.1条 和7.2 条。 8 扩增体 系配 制 与 扩增 8.1 采用实时 荧光 PCR 检 测试 剂，根据 试剂 说 明书

9、 配制 荧光 PCR 扩 增体 系，N 亚 基因 组 反应 体系 中 上/ 下游 引物 （20 mol/L ）0.4 L/ 0.4 L ， 探针 （10 mol/L ）0.4 L 每个反应 体 系 中加 入模板 RNA 4 L ( 或阳性 、阴 性对 照)、无 RNAase 灭 菌水 加 至 20 L 。 8.2 按以下 参数 进行 荧 光 PCR 扩增 （具 体扩 增条 件可 根 据实时 荧 光 PCR 检测 试剂 进行调 整 ） ， 42 5 min ，95 10 sec ，45 个 循环的 95 5 sec ，55 34 sec ， 在每 个 55 反应 结束时 收集 荧光 信号 。 9

10、 结果判 定 9.1 阈值设 定 阈值设 定原 则以 阈值 线刚 好超过 阴性 对照 扩增 曲线 的最高 点， 结果 显示 阴性 为准。 9.2 质控标 准 9.2.1 一般要 求 检测结 果中 的阴 、阳 性对 照均符 合以 下情 况， 如对 照不成 立， 此次 试验 视为 无效。 9.2.2 阴性对 照 阴性对 照无 扩增 曲线 ，或 Ct 值 大于40 。 9.2.3 阳性对 照 阳性对 照出 现典 型的 扩增 曲线呈 S 型， 且 Ct 值 小 于或等 于35 。 9.3 结果判 断 9.3.1 阳性判 定： 检测 样本 N 亚 基因 组 的 Ct 值 小于 或等 于 40 ， 并 有

11、明显 扩增 曲线 ， 则判 定为 亚基 因 阳性。 9.3.2 阴性判 定 ： 在 对照 成立 下 ， 如 果检测 样本 N 亚 基因 组没有 出现 扩增 曲线 ， 或 Ct 值 大于 40，则 判定为 亚基 因 阴 性。 9.3.3 不确定 结果 ： 在 对照 成立 下， 如 果检 测样 本 N 亚基因 组扩 增曲 线不 典型 ， 结 果不确 定， 建议 重 复检测 。 DB32/T 3762.142021 3 A A 附 录 A （规范 性附 录） 新型冠 状病 毒 N 亚基因 组 实时荧 光 PCR 引 物与 探针 序列及 阳性 对照 片段 序列 A.1 表A.1 中 给出 了新 型冠

12、状 病毒N 亚 基因 组实 时荧 光PCR 检测 的引 物与 探针 及阳 性对照 片段 序列 。 表A.1 新型冠 状病 毒 N 亚基因 组 实时荧 光 PCR 引 物与 探针 序列及 阳性 对照 片段 序列 引物名 称 引物序 列(5to3) 长度（bp） nCov-SgRNA N-F ACCAACTTTCGATCTCTTGTAGA 23 nCov-SgRNA N-R TGAGGGTCCACCAAACGTA 19 nCov-SgRNA N-Probe CAGCGAAATGCACCCCGCA 19 阳性对 照新 型冠 状病 毒 N 亚 基因片 段 ACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTT CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTATGTCTGATA ATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCC GCATTACGTTTGGTGGACCCTCA 115 _