DB15 T 2555—2022 原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法.pdf

1、 ICS 65.020.30 CCS B40 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2555 2022 原 代奶牛 乳腺上皮 细胞分离 培养及鉴 定技术规程-乳 汁分离法 Technical regulation of the isolation,primary culture and identification of Bovine Mammary Epithelial Cells derived from fresh milk 2022-04-25 发布 2022-05-25 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 2555 2022 I 前 言 本文件 按照G

2、B/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由内 蒙古 自治 区畜 牧业标 准化 技术 委员 会（SAM/TC 19）归口。本文件 起草 单位：内 蒙古 自治区 农牧 业科 学院、内 蒙古大 学。本文件 主要起 草人：杜瑞 平、王 潇、特 日格 勒、张 兴夫、崔新洁、赵 濛、云 伏雨、张春华、羿 静、康长清。DB15/T 2555 2022 1 原代奶牛 乳腺上 皮细胞分 离培养 及鉴定技 术规程-乳汁分离 法 1 范围 本文件 规定了 乳汁 分离法 培养鉴 定原代 奶牛 乳腺上 皮细胞 的术语 与定 义、材 料、仪

3、 器和试 剂耗 材、操作步 骤等 技术 要求 与规 范。本文件 适用 于从 奶牛 乳汁 中分离 培养 和鉴 定原 代奶 牛乳腺 上皮 细胞。2 规范性 引用 文件 本文件 没有 规范 性引 用文 件。3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。原代奶 牛乳 腺上 皮细 胞 primary bovine mammary epithelial cells 从奶牛 乳汁 或乳 腺中 分离、培养 并鉴 定出 来的 上皮 细胞。免疫荧 光技 术 immunofluorescence technique 又称 荧 光抗 体技 术，是以 荧光物 质 标 记抗 体，利用 抗原抗 体反 应 进 行组

4、 织或 细胞内 抗原 物质 的检 测和定位。染色体 组型 分析 karyotype analysis 对不同 生物的 染色 体组型（有丝 分裂中 期的 染色体 数目及 其特征）进 行定性 和定量 的分析 和研 究。4 材料 乳汁来 源 泌乳前 期（22 d 100 d）健康奶 牛。取样 用无菌 水及75%酒精 擦洗 奶牛乳 房，挤牛 乳约500 mL 分装 于灭 菌的 蓝盖 瓶中，37 保 温瓶 保温 带回实验 室。DB15/T 2555 2022 2 5 仪器和 试剂 耗材 仪器 生物安 全柜，CO2 培 养箱，高压蒸 汽灭 菌锅（137，0.25 MPa），普通 光学 显微镜，超 低温 冰

5、箱（-50-86），PCR 仪，电 泳仪，凝 胶成 像仪，低速 冷冻 离心 机（2000 g，-8 10），低温高速 台式 离心 机（20000 g，-8 10），酶 标仪，恒温 水浴 锅，倒置 荧光显 微镜（40 x 640 x）。试剂与 耗材 5.2.1 试剂 PBS缓 冲液，0.25%胰 蛋白 酶，细 胞冻 存液，0.4%台 盼蓝，MTT(0.5 mg/mL)，二甲基 亚砜(DMSO)，总RNA 提取 试剂 盒，DNA 水 解酶，反转 录试 剂盒，PCR 试剂盒，Taq 酶，琼 脂糖，4%多 聚甲 醛，山羊 血清（10%），兔 抗人 角蛋 白8 多克隆 抗体，FITC 标记 的 山羊抗

6、兔IgG，DAPI（10 g/mL），秋水 仙素（5 g/mL），0.2%TritonX 100，10%Giemsa 染色 液 等。5.2.2 配制溶 液组 分 完全培 养液：10%FBS+DMEM/F12+100 U 青 链霉 素双 抗+氢化 考的 松（1 g/mL）+孕酮（1 g/mL）+转铁 蛋白（5 g/mL）+胰岛素（5 g/mL）+谷 氨 酰胺（200 mmol/L）+EGF（10 ng/mL）。核型分 析固 定液：甲 醇：冰醋酸 为3:1。5.2.3 耗材 T25细 胞培 养瓶，96 孔细 胞 培养板，90 mm 培养 皿，0.22 M滤 膜，15 mL/50 mL 离心管，2

7、mL 细胞冻存管，无 酶PCR 管，移 液 器，血 球计 数板 等。6 操作步 骤 分离培 养 6.1.1 分离 6.1.1.1 在生物 安全 柜中，将 200 mL 乳 汁与 含青 链霉 素双 抗（100 U/mL）的 PBS 按 体 积比2：1 混合后，分装 于15 mL 无 菌离 心管中，500 g 离心 20 min，自 上而 下吸 弃上 层乳 脂 层及相 邻乳 白色 浑浊 层的一半。6.1.1.2 向剩余 液体 中加 入等 量含 青链霉 素双 抗（100 U/mL）的PBS，再次500 g 离心 15 min，自上而下缓 缓吸 弃大 部分 上清 层，重 复上 述步 骤，直至 剩余 1

8、 mL 左右。6.1.1.3 将所有 剩余 液体 收集 于一 个 15 mL 无 菌离 心管 中，等量 PBS 重 悬，500 g 再 次离 心5 min，自上而 下缓 缓吸 弃大 部分 上清层，重 复上 述步 骤，直至剩 余 1 mL 左右，即 为 乳汁中 分离 到的 细胞 层。6.1.2 培养 向细胞 层中 加入5 mL 完全 培养液，接 种于T25 细胞 培 养瓶中，于37、5%CO2 培养 箱中 培养，每隔48 h 换液。待 细胞 形成 单克隆 后，原瓶 胰酶 消化，长至80%汇集 时，传代 培养。传代培 养 DB15/T 2555 2022 3 待细胞 长至80%汇集 时，吸弃培 养

9、液，用PBS 清洗 细 胞两次；T25 培 养瓶 加1 mL 胰酶消 化液，37 消化10 min，普通 光学 倒 置显微 镜下 观察 到细 胞变 圆脱落 后，加入 至少200 L胎 牛血 清终 止消 化，反复吹打 细胞，使 细胞 完全 脱落，300 g离心5 min，弃上清，将 收集 的细 胞按1:3 的比 例接 种于 新培 养皿中，于37、5%CO2 培养 箱中培 养，每隔48 h 换液，待长 至80%汇 集时，继 续传代 培养 或将 细胞 冻 存备用。冻存和 复苏 6.3.1 冻存 上述方 法消 化细 胞，用血 清终止 反应，用 血球 计数 板计数 后，300 g 离心5 min，弃上

10、清，根 据细 胞数量计算冻 存支数，沿管壁缓缓加入 冻存液使细胞密度为2106/mL，用吸管轻轻吹打，令细胞处于重悬状态。分 装入 无菌 冻存 管中，每瓶1 mL 细胞 悬液。标记 冻存 日期、细 胞名 称、培 养代 数等 信息，放 入程序降 温盒 中，快速 置于-80 超低 温冰 箱中 冻存，24 h后 转入 液氮 罐中 保存。6.3.2 复苏 将冻存 管从 液氮 罐中 小心 取出，迅速 浸没 在40 温 水的恒 温水 浴锅 中解 冻，解冻时 间尽 量控 制 在1 min 左右。用 培养 液重 悬 离心以 清洗 冻存 液，保护 细胞。用移 液枪 吸出 细胞 悬液，缓慢 移入 加有 完 全培养

11、液 的细 胞培 养瓶 中，于37、5%CO2 培养 箱中 培养，待 长至80%汇集 时，可继续 传代 培养 或冻 存。细胞生 长曲 线测 定 采用MTT 法，参 考文 献1。角蛋 白8、18 和-酪蛋 白 测定 6.5.1 引物设 计 根据NCBI 上 公布 的牛 基因 序列设 计引 物，引物 序列 符合附 录A。6.5.2 RT-PCR 复苏培 养，生 长到80%汇 集时，用 胰酶 消化 并收 集 细胞，用 总RNA 提取 试剂 盒 抽提细 胞总RNA。为 排除基因 组DNA 的污染，用DNA 酶消化 处理 后，用 反转 录 试剂盒 反转录，用PCR 反 应 试剂盒 进行扩 增反 应并电泳检

12、 测扩 增产 物。PCR 扩 增反应 条件 均为95，5 min；95，30 s；62，30 s；72，30 s；72，10 min；30 个循 环。扩增 体系 符合 附录B。细胞免 疫荧 光染 色法 鉴定 角蛋 白 8 6.6.1 固定 细胞复 苏培 养，生长 到80%汇集 时，吸弃 培养 液并 用PBS清 洗细 胞23次，常 温 下多聚 甲醛 固定30 min，用PBS 清洗 细胞3次，每次5 min 10 min。6.6.2 封闭 TritonX 100处理5 min，用PBS 清洗 细胞3 次，每次5 min 10 min；山羊 血清 封闭30 min。6.6.3 抗体处 理 DB15

13、/T 2555 2022 4 加一抗（兔抗 人的 细胞 角 蛋白8 多克 隆抗 体100 倍稀 释，空白 对照 试验 用PBS 代 替）于37 下振 荡孵育1 h 或4 过 夜孵 育，用PBS 清 洗细 胞3次，每 次5 min 10 min；加 入二 抗（50 倍稀 释的FITC 标记 的 山羊抗兔 的IgG）并于 室温 下 避光振 荡孵 育30 min，用PBS 清洗 细胞3次，每 次5 min 10 min。6.6.4 鉴定 加入DAPI 染 色液 于室 温避 光孵育10 min，荧 光显 微 镜下观 察结 果。正 常奶 牛 乳腺上 皮细 胞会 呈强 阳性，发 出绿 色荧 光，核为 蓝色

14、荧 光；空白 对照 组的 细胞检 测呈 阴性。参 照图 见附录C。染色体 中期 分裂 相制 备与 组型分 析 6.7.1 细胞复 苏培 养与 消化 复苏步 骤同6.3.2，生长 到80%汇集 时，向培 养液 中 加入秋 水仙 素使 其终 浓度 为0.1 g/mL，在37、5%CO2 培养 箱中 继续培 养3 h 4 h；消化 步骤同6.2。6.7.2 分裂相 制备 缓缓加 入5 mL 低渗KCl（0.075 M，37 预 热），并 轻吹细 胞使 其悬 浮，37 孵育30 min，加入1 mL 新鲜 配制 的核 型分析 固定液 预固 定3 min，300 g 离心5 min，弃上 清，加 入新鲜

15、 配制 的核 型分 析 固定液6 mL，并 轻吹 细胞 使 其悬浮，室 温孵 育30 min，重复 固定 细胞2次 并离 心 后，小 心吸 除大 部分 上清液，余 下0.5 mL 固定 液，轻吹细 胞使 其悬 浮。6.7.3 制片染 色 用滴管 吸取 少量 细胞 悬液，从1 m 高 处滴 落在 洁净 载 玻片上（-20 预 冷），迅速于 酒精 灯上 过火烤干，将制 作的 标本 浸入Giemsa 染色 液浸 染10 min，流水冲 洗至 水流 无色 并自 然风干。6.7.4 观察照 相 染色体 标本 首先 用低 倍镜 检查，当 寻找 到分 散良 好、轮廓清 晰的 分裂 相后，换 用高倍 镜和 油

16、镜 观察拍照。6.7.5 组型分 析 拍照后 进行 染色 体组 型的 排列分 析。染色 体数 目应 为60，2 n=60；核型为60，XX。其 中29 对常 染 色体为端 着丝 粒染 色体，一 对性染 色体 是近 端着 丝粒 染色体。参 照图 见附 录C。DB15/T 2555 2022 5 A A 附录A（规范 性）PCR 扩 增反 应引 物 牛基因 序列 设计 引物 见表A.1。表A.1 PCR 扩增 反应 引物 Gene Bank 序列号 基因 引物序列(5-3)产物长度 NM_001033610.1 角蛋白 8 F:TGGAAGGGCTGACTGATGAG 540 bp R:GCTTC

17、CTGTAGGTGGCAATC NM_001192095.1 角蛋白18 F:CAGGGCGAGAAGGAGACCAT 504 bp R:TAAGGTCCTGAGGTTTGGGG NM_181008.2-酪蛋白 F:ATCCCTAACAGCCTCCCAC 303 bp R:AGAAAGGGACAGCACGGAC DB15/T 2555 2022 6 B B 附录B（规范 性）PCR 扩 增反 应体 系 PCR扩 增反 应体 系见 表B.1。表B.1 PCR 扩增 反应 体系 无酶水 7.2 L 上游引物（10 mol/L）0.4 L 下游引物（10 mol/L）0.4 L SYBR Premi

18、x Ex Taq(2)10 L cDNA 模板 2 L 总计 20 L DB15/T 2555 2022 7 C C 附录C（资料 性）奶牛乳 腺上 皮细 胞 CK-8 鉴 定及染 色体 组型 分析 参照 图 A、B：正常 奶牛 乳腺 上皮 细胞，其中A是 荧光 显微 镜 拍摄，细胞 发出 绿色 荧光，B是 普通 光学 显微 镜拍摄；C、D：对 照组，其 中C是 荧光 显微 镜拍 摄，细 胞核呈 蓝色，D 是普 通光 学 显微镜 拍摄 见图C.1。图C.1 细胞 免疫 荧光 组化 鉴定 奶 牛乳腺 上皮 细胞 角蛋 白 8 A：镜 下染 色体 原图；B：染色体 组型 的排 列见 图C.2。图C

19、.2 奶牛 乳腺 上皮 细胞 染色 体 组型分 析 DB15/T 2555 2022 8 参考文 献 1 Jingjing Wang,Changming Guo,Zhengkai Wei,et al.Morin suppresses inflammatory cytokine expression by downregulation of nuclear factor-B and mitogen-activated protein kinase(MAPK)signaling pathways in lipopolysaccharide-stimulated primary bovine mammary epithelial cells J Dairy Sci.2016,99(4):3016-3022.