DB15 T 2593—2022 冰草组织培养技术规程.pdf

1、 ICS 65.020.20 CCS B 21 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2593 2022 冰草组织 培养技术 规程 Technical code of practice for tissue culture of agropyron cristatum 2022-06-24 发布 2022-07-24 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 2593 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由内 蒙古 自治 区林 业和草 原局 提出

2、并归 口。本文件 起草 单位：中 国农 业科学 院草 原研 究所、内 蒙古农 业大 学。本文件 主要 起草 人：徐春 波、王 勇、赵海 霞。DB15/T 2593 2022 1 冰草组织 培养技 术规程 1 范围 本文件 规定 了冰 草组 织培 养的术 语与 定义、培 养基、外植 体、愈伤 组织 诱导 培养、增殖 培养、分 化培养、生根 培养、炼 苗与 移栽等 基本 内容 及技 术要 求。本文件 适用 于冰 草组 织培 养育苗。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版

3、本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 603 化学 试剂 试 验 方法中 所用 制剂 及制 品的 制备 NY/T 2306-2013 花 卉种 苗组培 快繁 技术 规程 DB 15/T 1940-2020 西 部 沙樱组 织培 养技 术规 程 3 术语和 定义 NY/T 2306 界定 的术 语和 定 义适用 于本 文件。冰草 agropyron cristatum(L.)gaertn 属于禾 本科（Gramineae）冰草属（Agropyron）多 年 生草本 植物。幼穗 young ear 生长2 至5年、长

4、度1 cm 3 cm 的 冰草 孕穗。种子 seed 有生活 力、饱满 的包 含内 外 稃的 冰草 种子。成熟胚 mature embryo 完熟期 冰草 种子 的胚。4 环境与 器具 灭菌 DB15/T 2593 2022 2 参照DB15/T 1940 执 行。5 培养基 基本培 养基 MS培养 基、1/2MS、改良MS培养基 见附 录A。母液的 配制 和保 存 5.2.1 配制 将 常 用 试 剂 配 制 成50 100 倍 的 母 液，按 照GB/T 603 规 定 方 法 配 制。所 用 激 素 均 配 制 浓 度 为0.5 mg/mL，配 制方 法详 见附 录B。5.2.2 保存

5、母液配 制好 分别 贴上 标签，注明 溶液 名称、配 制倍 数、配 制日 期、配制 者。母液贮 存在4 的冰 箱中。贮 藏时 间在3个 月之 内，有霉 菌和 沉淀 产生，则 不得使 用。培养基 的配 制 5.3.1 配制 配置1 L 培 养基 时，先加 蒸 馏水600 ml 700 ml，再 加入7.5 g 琼脂，加 热搅 拌 琼脂融 化后 加入25 g蔗糖，搅拌 溶解 后再 分别 加入母 液，搅拌 均匀，加 蒸馏水 定容 至1 L。5.3.2 pH 值 调节 用1 mol/L 的NaOH 将 配制 好 的培养 基调 到pH 值5.8 6.0，用 酸度 计或 精密pH 试 纸 测定。5.3.3

6、 分装和 灭菌 配制好 的培 养基 趁热 分装。分装量 以占 培养 容器 的1/4 1/3 为宜。切 勿将 培养 基 沾到瓶 口和 外壁 上，以免招 致杂 菌污 染。分 装后 立即加 盖，不 同的 处理 做好 标记。分 装后 进行 灭菌，121 状态 下保 持20 min。6 外植体 外植体 选择 幼穗或 成熟 胚。外植体 制备 6.2.1 幼穗 在超净 台上 用75%酒 精脱 脂 棉球擦 洗叶 鞘表 面消 毒，剥出幼 穗，切成0.3 cm 0.5 cm 的小 段。6.2.2 成熟胚 DB15/T 2593 2022 3 种子用 水浸 泡2 h 4 h 后，剥去内 外稃，置于 湿滤 纸 上吸胀

7、4 h。在超净 工作 台 上75%酒精 消毒30 s，无菌水 冲洗 至少3次 后用0.2%升汞 消毒5 min，再用 无 菌水冲 洗数 次至 少3 次。置 于铺有 湿无 菌滤 纸的 培养皿中，用 解剖 针从 盾片 处挑出 胚。7 愈伤组 织诱 导培 养 幼穗 7.1.1 培养基 幼穗愈 伤组 织诱 导培 养基 为改良MS+2.0 mg/L 2，4-D。7.1.2 接种 将幼穗 段接 种在 愈伤 组织 诱导培 养基 上，每2.5 cm23 cm2接种1个，均 匀摆 放，封 好皿 口，标明 名称和日 期。7.1.3 培养条 件 24 26 暗 培养。7.1.4 培养时 间 培养20 d 30 d。

8、成熟胚 7.2.1 培养基 成熟胚 愈伤 组织 诱导 培养 基为MS 0.2 mol/L 甘露 醇+2.0 mg/L 2，4-D。7.2.2 接种 将成熟 胚接 种在 愈伤 组织 诱导培 养基 上，每1.5 cm22 cm2接种1个，均 匀摆 放，封 好皿 口，标明 名称和日 期。7.2.3 培养条 件 见本文 件7.1.3。7.2.4 培养时 间 培养14 d 20 d。8 增殖培 养 幼穗 8.1.1 培养基 幼穗增 殖培 养基 为改 良MS+2.0 mg/L2，4-D+0.2 mg/L 6BA。8.1.2 接种 DB15/T 2593 2022 4 在超净 工作 台上，将 诱导 出的愈

9、伤组 织转 到增 殖培 养基上，每4 cm25 cm2接种1个，均 匀摆 放，封好皿口，标 明名 称和 日期。8.1.3 培养条 件 见7.1.3。8.1.4 培养时 间 培养40 d 50 d；每20 d 换1次 培养 基。成熟胚 8.2.1 培养基 成熟胚 增殖 培养 基为MS0.2 mol/L 甘 露醇+2.0 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L ABA。8.2.2 接种 在超净 工作 台上，将 诱导 出的愈 伤组 织转 到增 殖培 养基上，每3 cm24 cm2接种1个，均 匀摆 放，封好皿口，标 明名 称和 日期。8.2.3 培养条 件 见7.1.3。8.2.4 培养时 间 培养

10、40 d 60 d；每20 d 换1次 培养 基。9 分化培 养 幼穗 9.1.1 培养基 幼穗分 化培 养基 为MS+3.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA。9.1.2 接种 在超净 工作 台上，挑 选状 态较好 的胚 性愈 伤组 织转 入分化 培养 基，每5 cm26 cm2接种1个，均匀摆放，封 好瓶 口，标明 名称 和日期。9.1.3 培养条 件 24 26，全天 光照 培养，光照 强度3000 Lux 4000 Lux。9.1.4 培养时 间 培养40 d 60 d；每20 d 换1次 培养 基。成熟胚 9.2.1 培养基 DB15/T 2593 2022 5 成熟胚 分化

11、 培养 基为MS3.0 mg/L KT 1.0 mg/L NAA。9.2.2 接种 在超净工 作台上，挑 选状 态较好 的胚 性愈 伤组 织转 入分化 培养 基，每5 cm26 cm2接种1个，均匀摆放，封好瓶 口，标 明名 称和日期。9.2.3 培养条 件 24 26，每天 光照 时间16 h，光照 强度3000 Lux 4000 Lux。9.2.4 培养时 间 培养60 d 90 d；每20 d 换1次 培养 基。10 生根培 养 幼穗 10.1.1 培养基 幼穗生 根培 养基 为改 良1/2 MS+0.1 mg/L NAA。10.1.2 接种 在超净 工作 台上，将 长至3 cm 4 c

12、m 的小 苗逐 一转 入 生根培 养基，每 器皿 接种1 苗，封 好瓶 口，标明名称 和日 期。10.1.3 培养条 件 见9.1.3。10.1.4 培养时 间 培养20 d 30 d。成熟胚 10.2.1 培养基 成熟胚 生根 培养 基为1/2 MS 0.5 mg/L NAA。10.2.2 接种 在超净 工作 台上，将 长至3 cm 4 cm 的小 苗逐 一转 入 生根培 养基 中，每器 皿接 种1苗，封 好瓶 口，标明名 称和 日期。10.2.3 培养条 件 见9.2.3。10.2.4 培养时 间 培养20 d 30 d。DB15/T 2593 2022 6 11 炼苗与 移栽 炼苗 选择

13、生 长健 壮的 组培 苗，打开封 口膜，放 在自 然光、室温 下2 d 3 d。基质 营养土 与蛭 石1:1 混 合。经 高压灭 菌后 装入 花盆 备用。移栽 取出组 培苗，洗 掉培 养基，栽入 花盆，浇水，放 入 温室，套上 带孔 的塑 料袋 保湿，一周 后取 掉，适当保温，常 规管 理。待苗 长至20 cm 30 cm 移 栽至 大田。DB15/T 2593 2022 7 A A 附录A（规范 性）基本培 养基 成分 基本培 养基 成分 见表A.1。表A.1 基本 培养 基成 分 类型 组分 MS 培养基 改良MS 培养基 大量元素 KNO3 1900.0 1900.0 NH4NO3 16

14、50.0 956.0 MgSO4 7H2O 370.0 370.0 KH2PO4 170.0 1160.0 CaCl2 2H2O 440.0 96.0 微量元素 MnSO4 4H2O 22.30 22.30 ZnSO4 7H2O 8.600 8.600 H3BO3 6.200 6.200 KI 0.830 0.830 Na2MoO46H2O 0.250 0.250 CuSO4.5H2O4 0.025 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 0.025 铁盐 Na2-EDTA 37.30 37.30 FeSO4.7H2O 27.80 27.80 有机物 甘氨酸 2.000 2.000 盐酸

15、吡哆辛 0.500 0.500 盐酸硫铵素 0.100 2.000 烟酸 0.500 1.000 肌醇 100.0 100.0 尼克酸-DB15/T 2593 2022 8 B B 附录B（规范 性）激素的 配制 激素配 置方 法见 表B.1。表B.1 激素 配置 方法 类别 名称 配制方法 灭菌方式 存储方式 生长素 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）用适量无水乙醇溶解后加入去离子水定容。高温灭菌 冷藏（4），密封，避光保存 萘乙酸（NAA）细胞分裂素 6-苄基嘌呤（6-BA）用适量 0.1M 的盐酸（HCL）溶 解后加入去离子水定容。高温灭菌 冷藏（4），密封，避光保存 激动素（KT）脱落酸 脱落酸（ABA）用适量无水乙醇溶解后加入去离子水定容。过滤灭菌 现配现用