DB15 T 2784-2022 食用向日葵品种鉴定 SNP标记法.pdf

1、 ICS 67.050 CCS X 04 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 27842022 食用向日葵品种鉴定 SNP 标记法 Varietal verification of the confection sunflower(Helianthus annuus L.)SNP marker technology 2022-08-30 发布2022-09-30 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 27842022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/

2、TC 20）归口。本文件起草单位：三瑞农业科技股份有限公司、华智生物技术有限公司、内蒙古自治区质量和标准化研究院。本文件主要起草人：JIUHUAN FENG(冯九焕)、常敏、唐顺学、陈海军、田冰川、涂伟伟、霍治军、李乐、安燕珂、魏志恒、张耀、侯敏、张龙梅。DB15/T 27842022 1 食用向日葵品种鉴定 SNP 标记法 1 范围 本文件规定了利用单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）分子标记进行食用向日葵（Helianthus annuus L.）品种鉴定的术语和定义、原理、仪器设备及耗材、试剂及溶液配制、检测程序与方法、数据采集和记录、真

3、实性验证、鉴定结果报告等要求。本文件适用于食用向日葵的品种鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB 4407.2 经济作物种子 第2部分：油料类 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。品种鉴定 variety verification 判定及验证供检品种

4、与对照品种是否为相同品种。单核苷酸多态性 single nucleotide polymorphism（SNP）基因组中基于单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应 kompetitive allele specific PCR（KASP）通过引物末端特异性碱基竞争性匹配DNA模板实现SNP基因型分型的聚合酶链式反应。推荐标记 recommended markers 能够最大程度地将供检品种与对照品种区分开来的优先选用的一组标记。DB15/T 27842022 2 基因型分型 genotyping 通过检测方法确定某品种（或遗传材料）的基因、DNA区段或遗传标记

5、的基因型。4 原理 不同向日葵品种的基因组间存在核苷酸序列差异，其中单核苷酸（A、C、G、T）多态性(SNP)在基因组内分布广泛、密度高，这种差异可以通过荧光标记的 KASP 基因型分型等技术进行检测。利用一套多态性高、稳定性好、品种区别力强、具良好基因型分型质量的推荐标记，检测供检样品与对照样品之间的 SNP 差异位点数目，从而判定及验证供检样品的品种真实性。5 仪器设备及耗材 所需仪器设备及耗材为：实时荧光定量 PCR 仪、全自动样品快速研磨仪、高速离心机、核酸浓度测定仪、微孔板离心机、微量移液器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、酸度计、磁力搅拌器、电子天平、冰箱等；微量离心管、普通枪头、384

6、孔 PCR 板（白色）、封板膜、钢珠等。6 试剂及溶液配制 试剂要求 6.1.1 所用试剂至少为分析纯或分子生物学纯。试剂配制用水应符合 GB/T 6682 规定的一级水要求。6.1.2 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O）、三羟基甲基氨基甲烷（Tris-base）、三氯甲烷、异丙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、乙醇、PCR Master Mix等。溶液配制 6.2.1 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）：称取 186.1 g Na2EDTA2H2O，溶于 800 mL 水中，加入固体NaOH（约 20 g）调 pH

7、 至 8.0，定容至 1000 mL，高压灭菌。6.2.2 1.0 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)：称取 60.55 g Tris 碱，溶于 400 mL 水中，用 HCl 调 pH 至8.0，定容至 500 mL，高压灭菌。6.2.3 2CTAB 提取液：分别称取 20 g CTAB 和 81.7 g NaCl，加水溶解，分别加入 40 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）、100 mL 1.0 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，加水定容至 1000 mL，高压灭菌。使用时，按 2%（M/V）加入聚乙烯吡咯烷酮 K30（PVP-K30）。6.2.

8、4 2KASP Master Mix：包括 Taq DNA 聚合酶、通用荧光引物、dNTP、镁离子、ROX 内参荧光染料。6.2.5 KASP 引物：包括 10 M Primer_Allele X、10 M Primer_Allele Y、10 M Primer_Allele C。7 检测程序与方法 样品要求 供检样品与对照样品应符合下列要求：DB15/T 27842022 3 供检样品和对照样品可以为幼叶或种子；供检样品与对照样品为种子时，样品的取样、分样应符合 GB/T 3543.2 的规定；供检样品与对照样品为种子时，样品的纯度应符合 GB 4407.2 的规定；供检样品允许采用混合样检

9、测或单株检测。混合样制备应至少来源于 30 个个体，单株检测应不少于 30 个个体。DNA 提取 本文件推荐采用CTAB法提取DNA，其它能满足PCR扩增质量要求的提取方法均可适用。具体操作如下：a)采集供检及对照样品的种子或幼嫩组织 200 mg300 mg，置于 2.0 mL 离心管，放入 4 mm 钢珠，用全自动样品快速研磨仪于 50 Hz 振动 50 s，重复 23 次，使叶片充分打碎；b)加入 600 L 于 65 预热的 CTAB 提取液，65 温浴 60 min，期间颠倒混匀多次；c)加入等体积的三氯甲烷，颠倒混匀 3 min，于 12000 rpm 离心 10 min；d)取上

10、清液 450 mL 于新的 1.5 mL 离心管，加 0.6 倍体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，12000 rpm离心 5 min，弃去上清液；e)用 300 L 70%乙醇溶液洗涤 2 遍，自然干燥后，加 200 L ddH2O 充分溶解 DNA；f)检测 DNA 浓度并稀释至 25 ng/L50 ng/L，置于 4 保存备用。PCR 检测 7.3.1 总则 配制反应体系时，应同时设置12个无DNA模板的阴性对照（NTC）。根据NTC信号强弱，判断最适扩增循环数。若NTC信号过高，与其它基因型掺杂，则应降低扩增循环数。7.3.2 推荐标记 标记选择的基本原则是：遗传多态性高、基因组上分布均匀、基

11、因型分型质量好、重复稳定性好等。本文件采用的SNP推荐标记及KASP引物序列见附录A。7.3.3 实时荧光定量 PCR 反应体系 本文件推荐以下PCR扩增反应体系（见表1），其中2KASP Master Mix含有dNTP、Taq DNA聚合酶、通用荧光引物及ROX荧光内参等。其它兼容KASP的SNP检测体系均适用于本文件。依据PCR缓冲液类型、微孔板类型及检测平台，试验条件可做相应调整。表1 PCR 扩增反应体系 成份 原浓度 终浓度 推荐用量（L）DNA 25 ng/L50 ng/L 7.5 ng/L15 ng/L 1.20 2KASP Master Mix 2 1 2.00 Primer

12、_Allele X 10 M 0.15 M 0.06 Primer_Allele Y 10 M 0.15 M 0.06 Primer_C 10 M 0.40 M 0.16 ddH2O-0.52 总体积-4.00 7.3.4 实时荧光定量 PCR 反应程序 DB15/T 27842022 4 荧光定量PCR反应按照下列程序进行：a)预变性：94 预变性 15 min；b)梯度 PCR：94 变性 20 s，65（每循环降低 0.8），退火和延伸 60 s，10 个循环；c)扩增：94 变性 20 s，57 退火和延伸 60 s，荧光信号读取，30 个循环。注：以上为推荐的基于实时荧光定量PCR仪

13、检测平台的操作程序和参考条件，其他如Genomics SNPLine、Array Tape、IntclliQube、微流控SNP芯片等利用KASP方法实现基因分型的检测平台同样适用于本文件。8 数据采集和记录 采用实时荧光定量 PCR 仪提供的数据分析软件，对每个标记产生的 SNP 荧光信号和基因型分型值进行分析。按照分型明确、NTC(无样品阴性对照)无特异性扩增的原则，保留或剔除该标记位点的数据。若一个样品的缺失标记位点数占比大于等于 5%，则不予采用，需重做。数据记录为 X/Y，其中 X、Y 为同一位点上两个不同的等位变异，即纯合基因型记录为 XX 或 YY，杂合基因型记录为 XY；缺失位

14、点记录为-/-。9 真实性验证 根据供检样品与对照样品在 96 个推荐标记中的差异位点数，进行品种真实性验证。实际检测中，允许首先采用 48 个随机挑选的标记进行检测，若出现大于 5 个以上的异型个体，可终止检测，进行结果判定。具体鉴定意见参考以下规则：当差异位点数大于等于 5 个时，排除两者为同一品种；当差异位点数大于等于 1 且小于等于 4 个时，不确定两者为同一品种；当差异位数等于 0 个时，不排除两者属于同一品种。注：对于有异议的样品，可按GB/T 3543.5的规定进一步开展田间小区种植鉴定。10 鉴定结果报告 品种真实性验证结果可参考下列方式进行填报：利用 个SNP引物，采用 平台

15、进行检测，与对照样品相比，供检样品中共检测出差异位点数 个，差异位点的SNP标记编号为 ，鉴定意见为 。DB15/T 27842022 5 A A 附录A （规范性）推荐标记的 KASP 引物序列及其信息 96个推荐标记的KASP引物序列及基因组位置信息见表A.1：表A.1 推荐标记的 KASP 引物序列及其信息 标记ID LG Primer_Allele X/Ya（5-3）Primer_Allele C（5-3）基因组位置b RCP01 1 TCTTTACCTGGTCCCACTGGTTA CTTTACCTGGTCCCACTGGTTG GGAAAACTCAGCGGGGCCCAT 1397147

16、 RCP02 1 TCATTATCATCTTCTCCGGTCACT CATTATCATCTTCTCCGGTCACC GGCAGAATGACTGCAGGACGGTA 108359927 RCP03 1 TGACATTTGTTGAATCAAGTGCCGAT GACATTTGTTGAATCAAGTGCCGAC CAGAGCAAAACGGGTTATTTTTCATGGAA 127046934 RCP04 1 GATTTGTGGGTCCCATGTGGCT TGTGGGTCCCATGTGGCC CTGCGAGCTCCTGCATGGTAGTT 132999965 RCP05 1 ATTTCGCGGTCAAAC

17、CGGCCA TCGCGGTCAAACCGGCCG CATTGACCCTGCGTTGAGGCGAT 140817683 RCP06 1 GCACACGCAGAGCACCTACTT GCACACGCAGAGCACCTACTC GTGTAAGATGTGGTAGACGCAGCTT 144989472 RCP07 2 ATGATTATTTAAAGAAGAAGAACCGTCGA ATTTAAAGAAGAAGAACCGTCGC CATTTCGGTTTTCTTTAAAACTGTTGTCAA 3234430 RCP08 2 GGAACTTTTCTACGTAAAATTAACCGAAAA GAACTTTTCTAC

18、GTAAAATTAACCGAAAG GCATTCGGTATAACTCGTGGCACTT 16757787 RCP09 2 GCATATTAACAGGCAAGAACACTTGT GCATATTAACAGGCAAGAACACTTGC GTCTGTAATGATCTTGCAGCTGCGAA 144865512 RCP10 2 CGGTGGCTATGGTGGTGGTAAT GGTGGCTATGGTGGTGGTAAC CCGCCACCACTATATCCTCCATAT 161173400 RCP11 2 GGTATAACAACTCATAAGACTTGCACAA GTATAACAACTCATAAGACTTGC

19、ACAG CGGATTTTGGTTACTTGCACAAGTGTAA 170734326 RCP12 2 AATTCCAGACGTCTGCGCACGT CCAGACGTCTGCGCACGC GTTCAACAGACGAGTACATCATCATCATT 174484195 RCP13 3 CCCAGTTCCAATCAAACGCCGAT CCAGTTCCAATCAAACGCCGAC TAGTACGGGACGATGCTGTTACGAA 4513575 RCP14 3 GAAATTCCGGTCCCGCATTCCAT AAATTCCGGTCCCGCATTCCAC GGACTTTGGTTTTGAGGATCGG

20、TGAA 113166971 DB15/T 27842022 6 表A.1 推荐标记的KASP引物序列及其信息（续）标记ID LG Primer_Allele X/Ya Primer_Allele C 基因组位置b RCP15 3 GGTAGATTAAAGAAACAGGCCTCT GGTAGATTAAAGAAACAGGCCTCC CGACAATTTGAGGCTTTTGTGGGCTT 142202147 RCP16 3 TACACTATGATTTCTAATATTTAACAAACTGA ACACTATGATTTCTAATATTTAACAAACTGG GAGGTTTTGAATGTTTGGTGTTGG

21、TTTTAT 165961910 RCP17 3 GTTCTTCATGTATTTAACGCCTTTCGT CTTCATGTATTTAACGCCTTTCGC ACGTACGTTACAAGTTAAGAAACTGTAAAT 171633367 RCP18 3 TTAGACCTGTATATACTAATCGCATGTAT AGACCTGTATATACTAATCGCATGTAC CCCATCTTCTAGAGCTAGCAGATGAA 174606695 RCP19 4 GGCTTACCATCTTGACATTATGGGTT GCTTACCATCTTGACATTATGGGTG TATGGCATCAACGAGGT

22、ATCCAGATAATA 456506 RCP20 4 TTCTCATATCCGCCAACACAAGAT TCTCATATCCGCCAACACAAGAC GGCGAGCCTGATGATGCTGCTA 6212891 RCP21 4 CTGCCACTTACGAACTAGACCT CTGCCACTTACGAACTAGACCC TGCTGAAGACATTCCTAAAATGGATGCAA 49035811 RCP22 4 GTTCCATTGTGATCTATGTCATCGGT CCATTGTGATCTATGTCATCGGG GCTTCCGGGCTTTCGATATCGATAA 200817960 RCP2

23、3 4 AATTAAACTCCCAAATCGGGGTCCA AAACTCCCAAATCGGGGTCCG GCCTCCTTTGCCTTCTTACGGTTAT 203305904 RCP24 4 GTTGGCCATTCCATTCATTTTAGTGT GTTGGCCATTCCATTCATTTTAGTGC CTGGATAAACTTACAACGATACAAAAGCTT 207798715 RCP25 5 GGTACTGTAGTTTATTAACACTAACGCTT GTACTGTAGTTTATTAACACTAACGCTC TCCGTTTATAGCGAACATGCCTAAACTTA 756598 RCP26

24、 5 TTCTCATGGGATTCCGCAAAAGCT CTCATGGGATTCCGCAAAAGCC TATATTAACAGTAGGAACAACACACACATT 6226605 RCP27 5 AATCAAGAGGGAAACAAGTGTCTTCA ATCAAGAGGGAAACAAGTGTCTTCG CGAATTACGCGCATTTCTTATGGAGTA 19637565 RCP28 5 CAAGGGTTGTATACAACACAAAGGCA AAGGGTTGTATACAACACAAAGGCG CAAGCTGCAAGTTTCTTTAGCAAATCCAA 154220962 RCP29 5 TCC

25、GGGTTCAGCATCTTGAAATTTT CCGGGTTCAGCATCTTGAAATTTC TGGCTGACCGATCGCCCATGAT 172357711 RCP30 5 GTTGGTGTTCTTTCAGCCTGTAGT GGTGTTCTTTCAGCCTGTAGC TTCAAAGTAACTTAAACCCTCATCCACCA 177669464 DB15/T 27842022 7 表A.1 推荐标记的KASP引物序列及其信息（续）标记ID LG Primer_Allele X/Ya Primer_Allele C 基因组位置b RCP31 6 GCATCTTTACCGACACTAAGCTC

26、ATT CATCTTTACCGACACTAAGCTCATC CGTACCAATTTCGCAAAATCGATCAACTT 5441370 RCP32 6 AGAAGCGTCCCAAACGCACTCT GAAGCGTCCCAAACGCACTCC GCTCCCCGTTACAAGATTCGGAAAA 9218248 RCP33 6 CCCATAAACACTCGTATCCGGA CCCATAAACACTCGTATCCGGC GAAGTTGGATGAGGAGGTGGTTAATTATA 17517674 RCP34 6 ATGTTGTGTTATGCAAGTGAGAGAGTT GTTGTGTTATGCAAGT

27、GAGAGAGTG CACCTTAACGATATTAACCCGATGGTTAT 38051242 RCP35 6 TATGCTTAAACATTATGGCTACAGCA ATGCTTAAACATTATGGCTACAGCC CCAATAATTACAATTGGTGATCAAACCGTT 62837136 RCP36 6 ATCTAACGCTATGGAAGCCTCTGAA CTAACGCTATGGAAGCCTCTGAG TCGCGTAGCCCTTTAAGTGGAGTTT 116716827 RCP37 7 CAAACCGACTGTTTCCCGGAACT AAACCGACTGTTTCCCGGAACC C

28、TAAGAACTTCAATCCGGTTGGGCAA 3731765 RCP38 7 TACGATGACGTTGTGGAACGACTT CGATGACGTTGTGGAACGACTC GCCTGATTTTAGATGGATCGTCTAAGTTT 115935118 RCP39 7 TGCAACCTTTCCGGACCCATTATT GCAACCTTTCCGGACCCATTATC CATCACTACACCAGGAGCACACATT 134769457 RCP40 7 TGCGTAAATGAGACCGATAATCTGT GCGTAAATGAGACCGATAATCTGC CAGGGGTGAAGCGAAATT

29、CCATCAA 142344833 RCP41 7 GAACCGGGTAACAAAGACAAGAGAT AACCGGGTAACAAAGACAAGAGAC GTCTTCATTATTTGGGATGATTGGGAGTT 145004151 RCP42 7 CGGTAACAACGACTGCATCA CTCGGTAACAACGACTGCATCG CCCGAAATCAGGAAAGCCGAAGAAA 147882845 RCP43 8 CGGACCATTTTGACCCATAATAGAAA CGGACCATTTTGACCCATAATAGAAG GGAAACGGGTCAAACAAGATTTGAGATAA 154

30、5473 RCP44 8 GCCTTCACCTATACAATAGAATTTATGTT GCCTTCACCTATACAATAGAATTTATGTC CATGCTTTTATCTGTTGGGGTACACATTT 6567492 RCP45 8 CCAATATGAATTCCATCCATTCACATACA CAATATGAATTCCATCCATTCACATACC ATGGGACTAATTTTGTTGTGGATGGGAAA 17006342 RCP46 8 GAGAGCGAGTTCACCAACATAATGT AGAGCGAGTTCACCAACATAATGC CCACGGTTGAACCCTGATACTTGT

31、T 48738858 DB15/T 27842022 8 表A.1 推荐标记的KASP引物序列及其信息（续）标记ID LG Primer_Allele X/Ya Primer_Allele C 基因组位置b RCP47 8 GAGTTAAACCTAATTGCAAGCCTGTA GAGTTAAACCTAATTGCAAGCCTGTG AGCGAGACCGAGAAAAGAGCCAAA 90753292 RCP48 8 CGCATTAACTGCTTAGGATCCATCT GCATTAACTGCTTAGGATCCATCC CACAACAAGAACACAAGATGTTGTAGGTT 119273967 R

32、CP49 9 CGTTCCTTTACTCATCCTAAACGCT GTTCCTTTACTCATCCTAAACGCC GTGGAAGTATCTCGATAGCGACGAA 3348193 RCP50 9 CATTTGAAAATGGGATGGTGCAGTCA TGAAAATGGGATGGTGCAGTCG GATGCATTTAGAGTGCGAGCATGTATAAA 18621914 RCP51 9 GCATCATCAAAGAATCGAGCTAGCA CATCATCAAAGAATCGAGCTAGCG AATTAAATTTCATTATGCTAGCTGACT 137888783 RCP52 9 TTTGAC

33、TGGCCTTACCCTTTTGCA GACTGGCCTTACCCTTTTGCG CGGCACTGAGAGTTAAAACAAATAGCTT 176732933 RCP53 9 CGAAGTCCGCCGGCGATACA GAAGTCCGCCGGCGATACG GCTGGTCTAACATCATCCTCACAGAA 183272138 RCP54 9 CATCTTGAAGTGGCCCAAAATCTAGT ATCTTGAAGTGGCCCAAAATCTAGC CCTTGTCTTTATAGTTTTAGTTGCTTAAAA 188917321 RCP55 10 AGTCAACCGAAAAAGGACTCGCT

34、T GTCAACCGAAAAAGGACTCGCTG AGCTTACCACCTTGGCATCGATA 4145820 RCP56 10 CAGCGGAGACCGACACTTTGAAA AGCGGAGACCGACACTTTGAAC TCACTGGTCAGACTGGATCCTGTT 11924743 RCP57 10 CAAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAAT AAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAAC CGAAACCTTGTGAAACTTGTTGGTTACTA 27896920 RCP58 10 GACCCATGTTTCGTTTTCTTCCACT ACCCATGT

35、TTCGTTTTCTTCCACC GCCGGAGAGGATAATACTTACAACCAT 165951333 RCP59 10 CGCTGACGAAACTCCGTGTACTT GCTGACGAAACTCCGTGTACTC AATGTTACCGGAGAGGCCATTGGAT 176713139 RCP60 10 CAAATCCTATGAAACATCGTCGTCAT CAAATCCTATGAAACATCGTCGTCACAGCGCTTGGAGACGCATAACATGTT 180201514 RCP61 11 GAAGTTTGACCAAAAATACTAGAATTCAACA AAGTTTGACCAAAA

36、ATACTAGAATTCAACG ACGATTCTTTACCTTCGGACACTATCAA 2468174 RCP62 11 CGCTACACAAGATTACAACGTTGCT GCTACACAAGATTACAACGTTGCC CGCCTATTCACGGGTCCTGTCAT 9495869 DB15/T 27842022 9 表A.1 推荐标记的KASP引物序列及其信息（续）标记ID LG Primer_Allele X/Ya Primer_Allele C 基因组位置b RCP63 11 ATCTTTGACACCACCAAACTCTAGTAT CTTTGACACCACCAAACTCTAGTA

37、C GTACATCCAAGGTTATGAAGACGCGAT 17635352 RCP64 11 TGGTGGGGACCATGAGCACA GGTGGGGACCATGAGCACC TCTGGTAGGAAGCCCGGGCAT 162896462 RCP65 11 CAATATTCGGATAACACCCTTCAGAAAA AATATTCGGATAACACCCTTCAGAAAG TCGGATAAAGTCGAAATGGCTTGTAGTTT 174974441 RCP66 12 TTTCAGGCTGAGTTGGAAGATCATAA CAGGCTGAGTTGGAAGATCATAG GACGTACAGCAAG

38、TGTCACTTGTGAT 1188124 RCP67 12 CAATCGAAAGAGGCGCAACACTTATA AATCGAAAGAGGCGCAACACTTATG GCCGTTGTATGTGAATTCTTCGGAGAT 5829759 RCP68 12 ATCAACTGTTACATAGCCGGCACA CAACTGTTACATAGCCGGCACG CACAATCTTGCAAAATGGCTGCAGCAT 13393767 RCP69 12 GATAATGGTTTCCCGGTCGAAGAAA ATAATGGTTTCCCGGTCGAAGAAG ACCGAACCGGCTCCTCCGTAAT 267

39、83877 RCP70 12 ATATGTACTTTAGATACATTTTATTGTAACTT ATATGTACTTTAGATACATTTTATTGTAACTC CTACCCCTCCCTGCACAAAAACATT 58926116 RCP71 13 GTTCCCCAAGAAAAGTACCATACGA CCCCAAGAAAAGTACCATACGG GTATCAAAGCAGAATGGCGAGGTCA 68749721 RCP72 13 ATAACTATCTTTACAGCTTTACAAACATTCTT AACTATCTTTACAGCTTTACAAACATTCTC GAAGATGCTGGTGTGATG

40、CAAGTGAA 82781576 RCP73 13 CCTGTTCGAACATCGGTAACGAAA CTGTTCGAACATCGGTAACGAAG TGGCAGTTTTGACCGATCGCTTGAA 89317748 RCP74 13 CAGAAACCATAAACTCTATATACATTTCTTAAT AGAAACCATAAACTCTATATACATTTCTTAAG GGTTCATGAGCATGTGTAATTTGACAAGTT 97896231 RCP75 13 GATAACGAAAGATCACACCGGGAT ATAACGAAAGATCACACCGGGAC CACTGGACCCACCGT

41、GAGACTT 156633180 RCP76 13 ATGAGAGTTAAGTAGCCAAGATCACA GAGAGTTAAGTAGCCAAGATCACG CATCTTGCGTGAAGCAAACATACCATTTA 165893994 RCP77 14 TACAAACTATGAGCATATGCATATCTAGT CAAACTATGAGCATATGCATATCTAGC GGATATGATCTGGGATGCTATTCTTGTTT 81446782 RCP78 14 TGTACAAAACCTGACATTAAACAGCATA GTACAAAACCTGACATTAAACAGCATG CTTATACTA

42、TCAGAAGTTGAAGCTTGAGAA 115156655 DB15/T 27842022 10 表A.1 推荐标记的KASP引物序列及其信息（续）标记ID LG Primer_Allele X/Ya Primer_Allele C 基因组位置b RCP79 14 GGCCGTGAAGTTGAAGGATAGGT GCCGTGAAGTTGAAGGATAGGC CCATCTAACCTATCCCTGATCCCAT 132691300 RCP80 14 GCGAATGGGCAAACGGTTGCTA CGAATGGGCAAACGGTTGCTG ACATCCAAAAGCCAGTGCAAGGGAA 15

43、5811112 RCP81 14 CATAATCGAGAGTAAAAAGTTGTAGTTTAA CATAATCGAGAGTAAAAAGTTGTAGTTTAC AGAATAAGAGATTCAGTACTCCACTGTGA 172073231 RCP82 15 GGAAGTCAAATCTCTAGTCACTCCT GAAGTCAAATCTCTAGTCACTCCC CACGCGAAATACGCGGGGAAGAA 3426781 RCP83 15 GTTAGACGAAGACGATAAGGTTATGTTA AGACGAAGACGATAAGGTTATGTTC GAAACTGGCAGCTTCATGACCCAAT

44、 6702056 RCP84 15 GCAACAACAATGGCACAATCTCTCAA CAACAACAATGGCACAATCTCTCAG GTGTGAAGTCTGGTGAATGAGAGGTT 9662439 RCP85 15 GGTAAGGTGTTGAATATTAATGTTCCGA GTAAGGTGTTGAATATTAATGTTCCGG ACATCACTCTGACAACCCATCCGTT 13483687 RCP86 15 GATAAACAAATAGCAGCCAAAGGCATAA ATAAACAAATAGCAGCCAAAGGCATAC GACACTTTGATCGTGCAAGGCACTA 1

45、75136004 RCP87 16 CAGCTCCCTGCAACTCAACCTA AGCTCCCTGCAACTCAACCTG GATAGAGGTGCGGCACTTGAAGTAA 3933425 RCP88 16 CATCGTTTGAATCGGATATTGTCCCA ATCGTTTGAATCGGATATTGTCCCG CACACTAGTCCATATCTATCGCTACATTA 27449909 RCP89 16 CAACGGGTTGATACCCGAGTAGT AACGGGTTGATACCCGAGTAGC TAGTGATGGGTATCTGTAAAAGGAATGAAA 170928359 RCP90

46、 16 GGCCTGGTGAGCATGTTACGATT GCCTGGTGAGCATGTTACGATC GCAGCCTGCATTACATGATACCTCAT 182092609 RCP91 16 GCCACTTTTGTTCTTGTTATTTTATGTGT GCCACTTTTGTTCTTGTTATTTTATGTGG CACCGTGCTATAAAAAAATAATATGTGCAA 202868750 RCP92 17 TCCGAAATTGGGTCCTGTTGCA CCGAAATTGGGTCCTGTTGCG GTCAACAGGTTGAACCCGAGCTAAA 2677421 RCP93 17 GACGG

47、TGATGGTGACGATGGA GACGGTGATGGTGACGATGGC TCCAGTCTTTCGACAAACCCGCATA 25309867 RCP94 17 CAATATGACAAAAACTAATTGTTTTGTTTT CTCAATATGACAAAAACTAATTGTTTTGTTTC CTGTTTTTCTCAACATCGTCGTCTTACTT 68841049 DB15/T 27842022 11 表A.1 推荐标记的KASP引物序列及其信息（续）标记ID LG Primer_Allele X/Ya Primer_Allele C 基因组位置b RCP95 17 CCCAAGCGGTTGAGAGCAGAT CCCAAGCGGTTGAGAGCAGAG TACACATGGGAGGAAACCTACCGTA 188174185 RCP96 17 AAATGAAGATAAGTTACTCTTGGCAAGAA ATGAAGATAAGTTACTCTTGGCAAGAG GAACGGATACTTTGCTGGCCGTTTA 192170594 a 每组引物上面序列是Allele X，下面序列是Allele Y，SNP位点用下划线标注。b 参照向日葵基因组版本HanXRQr2.0（https:/www.heliagene.org/）。