DB43 T 959.1-2023 异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogen Free, DPF）医用供体猪 第1部分：遗传质量控制.pdf

1、异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogen Free,DPF）医用供体猪第1部分：遗传质量控制DB43/T 952023 9.143湖南省地方标准发 布湖南省市场监督管理局2023-11发布-092024-02实施-09代替DB43/T 95.20149 1Medical grade DPF donor pig for xenotransplantationPart 1:Genetic quality controlICSCCS 70.080 B 44DB43/T 959.12023 I 目 次 前言 引言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 遗传分

2、类及命名 2 5 繁殖 2 6 近交系异种移植用无指定病原体（DPF）医用供体猪的遗传质量监测 3 7 封闭群异种移植用 DPF 医用供体猪的遗传质量监测 4 DB43/T 959.12023II DB43/T 959.12023 III 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是 DB43/T 959异种移植用无指定病原体（Designated Pathogen Free,DPF）医用供体猪的第 1 部分。DB43/T 959 已发布了以下部分：第 1 部分：遗传质量控制；第 2 部分：微生物、寄生虫学等级与监测；

3、第 3 部分：配合饲料；第 4 部分：病理学诊断规范；第 5 部分：环境与设施。本文件替代 DB43/T 959.12014异种移植用无指定病原体（Designated Pathogen Free,DPF）医用供体猪 第 1 部分：遗传质量控制，与 DB43/T 959.12014 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a）增加了“引言”一章；b）更改了术语“近交系”定义（见 3.2，2014 版的 3.2）；c）更改了术语“封闭群”定义（见 3.3，2014 版的 3.3）；d）更改了“表 1 近交系异种移植用 DPF 医用供体猪遗传检测抽样要求”、“表 4 封闭群异种移植用 D

4、PF 医用供体猪遗传检测抽样要求”中“抽样数量”（见 6.2、7.2，2014 版的 6.2、7.2）；e）增加了近交系微卫星检测内容（见表 3）；f）更改了封闭群微卫星检测内容（见表 5，2014 版的表 4）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省科学技术厅提出并归口。本文件起草单位：中南大学湘雅三医院，湖南赛诺生物科技股份有限公司。本文件主要起草人：王维、胡鹏志、马小倩、李桑、徐畅、王佳、石兴勇。本文件及其所替代文件的历次版本发布情况为：2014 年首次发布为 DB43/T 959.12014；本次为第一次修订。DB43/T 959.12

5、023IV DB43/T 959.12023 V 引 言 异种移植用无指定病原体（Designated Pathogen Free,DPF）医用供体猪标准化能更好的促进异种细胞、组织和器官移植相关产业发展，有利于湖南省政府部门行政审批和监管工作的实施。为了保证异种移植用无指定病原体医用供体猪研发、生产和应用的稳定、高效进行，对其进行标准化管理已成为首要任务。在这方面，湖南省已建立了异种移植用无指定病原体医用供体猪基础性地方标准体系。在该体系中，DB43/T 959异种移植用无指定病原体（Designated Pathogen Free,DPF）医用供体猪是指导湖南省异种移植用无指定病原体医用供

6、体猪培育的基础性和通用性的标准。DB43/T 959 旨在确立普遍适用于标准化异种移植用无指定病原体医用供体猪遗传质量控制、微生物检测、饲料、病理学检测、环境设施的准则，拟由五个部分构成。第 1 部分：遗传质量控制。目的在于维持异种移植用无指定病原体医用供体猪遗传质量稳定性。第 2 部分：微生物、寄生虫学等级与监测。目的在于保证异种移植用无指定病原体医用供体猪生物安全性。第 3 部分：配合饲料。目的在于保障异种移植用无指定病原体医用供体猪饲料的安全和营养。第 4 部分：病理学诊断规范。目的在于标准化异种移植用无指定病原体医用供体猪病理学检测内容和方法。第 5 部分：环境与设施。目的在于标准化异

7、种移植用无指定病原体医用供体猪环境条件控制和设施建设。遗传质量控制标准化是为了建立稳定且高质量的异种移植用无指定病原体医用供体猪种群。为了做好这项工作，湖南省在 2014 年发布了有关异种移植用无指定病原体医用供体猪遗传质量控制规定的地方标准。DB43/T 959.1 发布实施已九年，这期间异种移植相关技术不断更新，供体猪遗传质量控制受到越来越广泛的重视，与遗传质量控制有关的理论研究和实践都发生了变化。首先，国际异种移植用无指定病原体医用供体猪遗传质量控制检测内容和方法的研究不断深入，充实和完善了异种移植用无指定病原体医用供体猪的遗传质量控制标准。其次，随着 WHO 更新国际异种移植规范201

8、8 长沙宣言以及 DB43/T 959.1 的广泛应用和深入实践，产生了新的需求与建议。鉴于此，确有必要修订完善 DB43/T 959.1，以不断适应国内外相关遗传质量控制检测的新变化以及异种移植用无指定病原体医用供体猪发展的新需求，确保高质量异种移植用无指定病原体医用供体猪的稳定发展。对异种移植用无指定病原体医用供体猪遗传质量控制进行标准化，首先需要明确其遗传分类；其次是检测标准。本次对 DB43/T 959.1 的修订，重点考虑了近交系和封闭群的区分以及检测方法，明确了近交系和封闭群的定义，并进一步清晰的规定近交系和封闭群微卫星检测方法，提高了各项检测的抽样标准。通过更加严谨的检测方法和抽

9、样数量，让异种移植用无指定病原体医用供体猪遗传质量控制更加稳定，从而提高异种移植用无指定病原体医用供体猪的质量和应用效率，更好地促进异种移植用无指定病原体医用供体猪的研发、生产和应用，推动异种移植临床研究发展。DB43/T 959.12023VI DB43/T 959.12023 1 异种移植用无指定病原体（Designated Pathogen Free,DPF）医用供体猪 第 1 部分：遗传质量控制 1 范围 本文件规定了异种移植用无指定病原体（Designed Pathogen Free,DPF）医用供体猪的遗传分类、繁殖方法和近交系及封闭群的遗传质量标准。本文件适用于异种移植用 DPF

10、 医用供体猪的遗传质量控制。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 14923 实验动物 遗传质量控制 NY/T 1673 畜禽微卫星 DNA 遗传多样性检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 异种移植用 DPF 医用供体猪 medical grade DPF donor pig for xenotransplantation 经人工饲养与培育，遗传背景明确或者来源清楚，12 月龄体重宜不超过 50

11、kg，不携带世界卫生组织（World Health Organization，WHO）指定供体动物应排除的潜在感染或条件致病和感染性人畜共患疾病病原，必须利用生物安全屏障环境防止病原体感染，不得使用抗生素或疫苗，用于医用异种移植供体、科学研究、教学、生产和质量控制鉴定以及其他科学实验的小型猪。3.2 近交系 inbred strain一个动物群体中，任何个体基因组中 98.6以上的座位为纯合的品系。注：经典近交系经至少连续 20 代的全同胞兄妹交配培育而成。品系内所有个体都可追溯到起源于第 20 代或以后代数的一对共同祖先。经连续 20 代以上亲子交配与全同胞兄妹交配有等同效果。近交系的近交系

12、数（inbreeding coefficient）大于 98.6。3.3 封闭群 closed colony不引进外部动物、在群体内随机选择动物进行繁殖，以维持有限杂合度的实验动物种群。DB43/T 959.120232 4 遗传分类及命名 4.1 遗传分类 根据遗传特点的不同，异种移植用 DPF 医用供体猪分为近交系和封闭群。4.2 命名 4.2.1 近交系 近交系一般以大写英文字母命名，亦可以用大写英文字母加阿拉伯数字命名，符号应尽量简短。如XENO 等。4.2.2 近交代数 近交系的近交代数用大写英文字母 F 表示。例如当一个近交系的近交代数为 30 代时，写成（F30）。4.2.3 其

13、它近交系 亚系、支系、重组近交系、同源突变近交系、同源导入近交系的定义和命名按照 GB 14923 执行。4.2.4 封闭群命名 封闭群的命名按照 GB 14923 执行。5 繁殖 5.1 近交系的繁殖 5.1.1 原则 选择近交系异种移植用 DPF 医用供体猪繁殖方法的原则是保持近交系小型猪的等位基因纯合性。5.1.2 引种 作为繁殖用种子的近交系异种移植用 DPF 医用供体猪，应来自近交系的基础群或血缘扩大群，遗传背景明确，有完整的资料（包括品系名称、近交代数、遗传标记特点及主要生物学特征等）。5.1.3 方法 可分为基础群（foundation stock）、血缘扩大群（pedigree

14、 expansion stock）和生产群（production stock）。当近交系小型猪生产供应数量不是很大时，一般不设血缘扩大群，仅设基础群和生产群。基础群、血缘扩大群和生产群的具体繁殖方式按照 GB 14923 执行。5.2 封闭群的繁殖 5.2.1 原则 选择封闭群异种移植用 DPF 医用供体猪繁殖方法的原则是保持封闭群小型猪的遗传异质性及基因多态性，避免近交系数增速过快。DB43/T 959.12023 3 5.2.2 引种 5.2.2.1 作为繁殖用种子的封闭群异种移植用 DPF 医用供体猪应遗传背景明确或来源清楚，有完整的资料（包括种群名称、来源、遗传基因特点及主要生物学特性

15、等）。5.2.2.2 根据繁殖方式，在保证每代近交系数增量不大于 1的前提下，决定最小引种规模。如采用循环交配方式，引种数量不得少于 13 对无血缘关系（三代以内无共同祖先）的公母猪；若采用随机交配方式，引种数量不得少于 25 对无血缘关系的公母猪。5.2.3 方法 封闭群保持封闭群异种移植用 DPF 医用供体猪的遗传基因的稳定，并尽量避免近亲交配。具体繁殖方法按照 GB 14923 执行。6 近交系异种移植用无指定病原体（DPF）医用供体猪的遗传质量监测 6.1 检测方法 采用微卫星 DNA 标记检测方法。具体方法按照 NY/T 1673 执行，各微卫星 DNA 标记的染色体位置、等位基因数

16、、等位基因片段范围、引物序列、荧光标记、PCR 反应的 Tm 值、镁离子浓度等见表 3。6.2 抽样 对基础群，凡在子代留有种猪的双亲动物都应进行检测。对生产群，按表 1 要求从每个近交系中随机抽取非同窝成年猪。表 1 近交系异种移植用 DPF 医用供体猪遗传检测抽样要求 生产群中种母猪数量（N）抽样数量 100头 不少于6头 100头 N 6 6.3 结果判定 近交系异种移植用 DPF 医用供体猪遗传检测结果的判定按表 2 执行。表 2 近交系异种移植用 DPF 医用供体猪遗传检测结果判定标准 检测结果判定与标准遗传概貌完全一致未发现遗传变异有一个位点的标记基因与标准遗传概貌不一致遗传发生变

17、异6.4 判定结论 所有样品检测微卫星 DNA 标记的等位基因都符合品系的特征，没有新的等位基因出现为合格异种移植用 DPF 医用供体猪近交系，否则判为不合格。6.5 检测频率 近交系异种移植用 DPF 医用供体猪生产群每年至少进行一次遗传质量检测。DB43/T 959.120234 表 3 各微卫星 DNA 分子标记所在的染色体位置、等位基因数、等位基因片段范围、荧光标记、两侧引物序列（左侧：F，右侧：R）、退火温度和镁离子浓度 序号 座位名称 染色体 位置 等位基 因数 （个）等位基因 片段范围 （bp）荧光 标记 引物序列 53 Tm（）Mg2+(mM)1 CGA 1 12 250-32

18、0 FAM F-ATAGACATTATGTAAGTTGCTGAT R-GAACTTTCACATCCCTAAGGTCGT 55 2.5 2 SW769 13 7 106-140 HEX F-GGTATGACCAAAAGTCCTGGG R-TCTGCTATGTGGGAAGAATGC 55 3.0 3 SW857 14 6 134-160 TAMRA F-TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC R-GATCCTCCTCCAAATCCCAT 55 1.5 4 S0005 5 10 200-248 FAM F-TCCTTCCCTCCTGGTAACTA R-GCACTTCCTGATTCTGGGTA

19、 55 3.0 5 SW240 2 11 92-114 TAMRA F-AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG R-AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA 58 1.5 6 S0355 15 14 243-277 HEX F-TCTGGCTCCTACACTCCTTCTTGATG R-TTGGGTGGGTGCTGAAAAATAGGA 55 3.0 7 SW72 3 8 100-116 TAMRA F-ATCAGAACAGTGCGCCGT R-GTTTGAAAATGGGGTGTTTCC 55 1.5 8 S0090 12 4 244-251 TAMRA F-CCAAGACTGCCTTG

20、TAGGTGAATA R-GCTATCAAGTATTGTACCATTAGG 55 1.5 9 S0218 X 11 158-196 TAMRA F-AAGATCATTTAGTCAAGGTCACAG R-TCTGATAGGGAACATAGGATAAAT 54 1.5 10 SW24 17 8 96-121 FAM F-CTTTGGGTGGAGTGTGTGC R-ATCCAAATGCTGCAAGCG 55 1.5 7 封闭群异种移植用 DPF 医用供体猪的遗传质量监测 7.1 检测方法 采用微卫星 DNA 标记检测方法。具体方法按照 NY/T 1673 执行，各微卫星 DNA 标记的染色体位置、等

21、位基因数、等位基因片段范围、引物序列、荧光标记、PCR 反应的 Tm 值、镁离子浓度等见表 5。7.2 抽样 按表 4 要求从每个封闭群中随机抽取非同窝成年猪。表 4 封闭群异种移植用 DPF 医用供体猪遗传检测抽样要求 群体数量 抽样数量 100 头 不少于15头 100 头 不少于30头 7.3 结果判定 群体内遗传变异采用平均杂合度指标或群体平衡状态方法进行评价。当平均杂合度在 0.5-0.7 时，且期望杂合度与观测杂合度经卡方检验无明显差异时，群体为合格的DB43/T 959.12023 5 封闭群异种移植用 DPF 医用供体猪群体。或用群体是否达到平衡状态来判定，如果没有达到平衡状态

22、，说明群体的基因频率或基因型频率发生变化，该封闭群异种移植用 DPF 医用供体猪群体判为不合格。具体方法按照 NY/T 1673 执行，各微卫星 DNA 标记的染色体位置、等位基因数、引物序列及荧光标记，PCR反应的 Tm 值、镁离子浓度见表 5。7.4 检测频率 封闭群异种移植用 DPF 医用供体猪生产群每年至少进行一次遗传质量检测。表 5 各微卫星 DNA 分子标记所在的染色体位置、等位基因数、等位基因片段范围、荧光标记、两侧引物序列（左侧：F，右侧：R）、退火温度和镁离子浓度 序号 座位名称 染色体 位置 等位基 因数 （个）等位基因 片段范围 （bp）引物序列 53 Tm（）Mg2+(

23、mM)1 SW974 1 17 129-175 F-GGTGAAGTTTTTGCTTTGAACC R-GAAAGAAATCCAAATCCAAACC 58 2.0 2 S0091 2 14 96-174 F-TCTACTCCAGGAGATAAGCCAGAT R-CAGTGACTCCATCACAGTTATGA 55 1.5 3 SW240 2 11 92-114 F-AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG R-AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA 58 1.5 4 SW1066 3 19 166-214 F-GCAGGATGAACCACCCTG R-CTCTTGAGGCAACCTGC

24、TG 60 2.0 5 SW1089 4 10 142-190 F-TTTTCCCCTTCACTCACCC R-GATCAAAGTCCCTTACTCCGG 58 1.5 6 S0005 5 10 200-248 F-TCCTTCCCTCCTGGTAACTA R-GCACTTCCTGATTCTGGGTA 55 3.0 7 SW1057 6 14 142-191 F-TCCCCTGTTGTACAGATTGATG R-TCCAATTCCAAGTTCCACTAGC 58 2.0 8 SW632 7 9 148-173 F-TGGGTTGAAAGATTTCCCAA R-GGAGTCAGTACTTTGGC

25、A 54 2.0 9 OPN 8 12 138-170 F-CCAATCCTATTCACGAAAAAGC R-CAACCCACTTGCTCCCACC 59 2.0 10 SW29 8 12 133-187 F-AGGGTGGCTAAAAAAGAAAAGG R-ATCAAATCCTTACCTCTGCAGC 61 2.0 11 SW911 9 14 151-178 F-CTCAGTTCTTTGGGACTGAACC R-CATCTGTGGAAAAAAAAGCC 60 2.0 12 SW511 9 12 161-196 AAGCAGGAATCCCTGCATC CCCAGCCACCAGTCTGAC 62

26、 1.5 13 SWr158 10 18 158-200 F-TCCAATTCAACTCCTGGCTC R-GAATGTGCACATACCACATGC 60 2.0 14 SW951 10 14 108-142 F-TTTCACAACTCTGGCACCAG R-GATCGTGCCCAAATGGAC 58 1.5 15 SW271 3 13 111-144 F-TTCCATGGCTTTCTTC R-CATTCATTCCCAGTGAAACTTG 58 1.5 16 S0386 11 12 155-178 F-TCCTGGTCTTATTTTCTA R-TTTTTATCTCCAACAGTAT 48 2

27、.0 17 S0068 13 10 210-256 F-CCTTCAACCTTTGAGCAAGAAC R-AGTGGTCTCTCTCCCTCTTGCT 62 2.0 DB43/T 959.120236 表 5 各微卫星 DNA 分子标记所在的染色体位置、等位基因数、等位基因片段范围、荧光标记、两侧引物序列（左侧：F，右侧：R）、退火温度和镁离子浓度（续）序号 座位名称 染色体 位置 等位基 因数 （个）等位基因 片段范围 （bp）引物序列 53 Tm（）Mg2+(mM)18 SWr1008 13 16 98-256 F-ACAGCCACCAACAGTGTTTG R-GAACTTCCATATGC

28、TGCAAGTG 62 2.0 19 S0007 14 15 142-192 F-TTACTTCTTGGATCATGTC R-GTCCCTCCTCATAATTTCTG 58 2.0 20 SW857 14 6 134-160 F-TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC R-GATCCTCCTCCAAATCCCAT 55 1.5 21 SWr312 15 11 116-136 F-ATCCGTGCGTTGTGCAT R-CTGGTGGCTACAGTTCGAT 64 1.5 22 SW81 16 8 128-144 F-GATCTGGTCCTGCACAGGG R-GGGGCTCTCAGGAAGGAG 60 1.5 23 SWr1120 17 11 147-178 F-CAAATGGAACCCATTACAGTCC R-ACTCCTAGCCCAGGAGCTTC 60 1.5 24 S0062 18 12 144-204 F-AAGATCATTTAGTCAAGGTCACAG R-TCTGATAGGGAACATAGGATAAAT 56 2.0 25 S0218 X 11 158-196 F-AAGATCATTTAGTCAAGGTCACAG R-TCTGATAGGGAACATAGGATAAAT 54 1.5