DB51 T 3065-2023 克氏原螯虾白斑综合征诊断和防控技术规程.pdf

1、 ICS 65.150 CCS B 52 四川省地方标准 DB51/T 30652023 DB51 克氏原螯虾斑综合征诊断和防控技术规程 2023-06-19 发布2023-08-01 实施四 川 省 市 场 监 督 管 理 局发布 DB51/T 30652023 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 诊断.1 5 预防.4 6 治疗.4 7 病死虾处理.4 附录 A（资料性）白斑综合征病毒基因参考序列.5 DB51/T 30652023 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。

2、请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件起草单位：四川农业大学。本文件主要起草人：黄小丽、耿毅、陈德芳、欧阳萍。本文件为首次发布。DB51/T 30652023 1 克氏原螯虾白斑综合征诊断和防控技术规程 1 范围 本文件规定了由白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)引起的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)白斑综合征的诊断、预防、治疗及病死虾处理等要求。本文件适用于克氏原螯虾白斑综合征的诊断以及四川行政区域内稻田和池塘养殖克氏原螯虾白斑综合征的防控。2 规

3、范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 11607 渔业水质标准 GB/T 28630.2-2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第2部分：套式 PCR 检测法 NY/T 5361 无公害农产品 淡水养殖产地环境条件 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 克氏原螯虾白斑综合征 white spot syndrome of

4、Protocrayfish clarkii 由白斑综合征病毒感染引起的克氏原螯虾发病或死亡的一种病毒性疾病。4 诊断 4.1 试剂和材料 4.1.1 试剂 检验中所需试剂的配制按照GB/T 28630.2-2012和SC/T 7014的规定执行，Taq Master Mix、10PCR缓冲液(无Mg2+)、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司提供的商品化试剂。除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂。4.1.2 水 应符合GB/T 6682中一级水的规格、且用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水。4.1.3 引物 DB51/T 30652023 2 外侧引物：F1:5-A

5、CTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3;R1:5-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA-3。用来扩增WSSV DNA的1447bp产物，-20保存。内侧引物（套氏引物）：F2:5-GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA-3;R2：5-TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT-3。用来从第一步PCR扩增的1447bp产物中再扩增出941bp的产物，-20保存。内参引物：F3：5-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3；R3：5-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3，扩增十足类动物DNA中848bp的片段产物，-20保存。4.2 设备

6、与器械 设备和器械应当符合GB/T 28630.2-2012的规定。4.3 临床检查 4.3.1 临床症状 患病克氏原螯虾主要临床症状为体色变暗、摄食减少、反应迟钝、活力较差。4.3.2 剖检 患病克氏原螯虾内脏器官大体病变不典型，主要表现为部分肠段中空无食物，肠壁透明，肠管较细；头胸甲易剥离；剥开头胸甲后部分病虾可在头胸甲与肌肉之间的膜上见到大量白色斑点。其余器官如肝胰腺、鳃等无明显变化。4.4 实验室样品采集 样品采集按 GB/T 28630.2-2012 中附录B的规定执行。4.5 DNA 提取 4.5.1 样品准备 4.5.1.1 活体或冰冻的仔虾及幼虾个体样品(去虾眼)约0.1g；活

7、体或冰冻的成虾鳃、心脏、肝胰腺、肠、步足、游泳足等组织样品约0.1g。4.5.1.2 将上述待检样品用生理盐水洗去血污，剪碎，放入灭菌后的1.5 mL离心管中，后用匀浆器将样品均浆成糊状，避免各样品间的交叉污染。所有非一次性使用的样品处理工具要经清洗，然后浸于新配制的75%酒精中5 min，无菌水充分清洗两次后，方可使用。4.5.2 提取 DNA 样品DNA提取按照GB/T 28630.2-2012中6.3的规定执行。4.5.3 微量分光光度计测定核酸浓度和纯度 4.5.3.1 在上样孔处点入1.5L无菌水，点样时不要有气泡残留，对仪器进行校准。4.5.3.2 校准完成后，用擦镜纸将无菌水擦干

8、净，之后点入1.5L待测样品，扣上样品盖，对待测样品进行核酸浓度和纯度的测定。合格的双链DNA的A260/A280应在1.71.9之间，若比值较高说明提取的DNA中有RNA残留，若比值较低说明有蛋白质残留。4.6 DNA 提取质量及体系监控 使用内参引物F3和R3，按照GB/T 28630.2-2012中6.4的规定进行样品提取质量及反应体系监控。4.7 套氏 PCR 操作 DB51/T 30652023 3 4.7.1 使用外侧引物 F1 和 R1，按照 GB/T 28630.2-2012 中 6.5.1 的规定进行第一步 PCR。4.7.2 使用内侧引物 F2 和 R2，按照 GB/T 2

9、8630.2-2012 中 6.5.2 的规定进行第二步 PCR。4.8 DNA 的序列测定 4.8.1 琼脂糖凝胶制作 琼脂糖凝胶的制作按照GB/T 28630.2-2012中6.6.1的规定执行。4.8.2 电泳 电泳按照GB/T 28630.2-2012中6.6.2的规定执行。4.8.3 PCR 扩增产物纯化、测序及序列比对 4.8.3.1 在长波紫外灯下用刀片切下套氏 PCR 扩增后含目的条带(约 941bp)的胶块，放入无菌离心管中称重。4.8.3.2 按每0.1g 琼脂糖凝胶加0.1mL酚，将酚加入4.8.3.1含有目的条带胶块的离心管中，漩涡震荡仪震荡 1min2min，将离心管

10、在-70 放置 1h，使凝胶完全冻结。4.8.3.3 37水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡震荡仪上震荡 1min2min；14000r/min 离心 5min，取上层水相转入另一个离心管中，加入等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)，混匀，12000r/min离心 5min。4.8.3.4 取上清液加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24:1)，混匀，12000r/min 离心5min。4.8.3.5 向收集的水溶液中加入1/10体积的3mol/L的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，-20过夜或-70 放置 1h2h。4.8.3.6 14000r/min 离心10min，弃上清，将沉淀的DNA溶于适

11、当体积的TE 缓冲液中，置-20保存，待测。4.8.3.7 纯化的PCR 扩增产物进行序列测定，并与参考序列(见附录 A)进行比对分析。4.9 套氏 PCR 结果判定 4.9.1 提取质量及体系监控 DNA提取质量和体系监控中，所有样品在848bp处应有一条特定条带。4.9.2 各对照组 第一步PCR，经琼脂糖凝胶电泳后，阳性对照在1447 bp处有条带，阴性对照和无菌水为模板设立的空白对照无任何条带；第二步PCR，经琼脂糖凝胶电泳后，阳性对照在941 bp处有条带，阴性对照和空白对照无任何条带。4.9.3 被检测样品 第一步PCR后在1447bp处有条带或第二步PCR后在941bp处有条带均

12、可判为阳性。检测样品第一步PCR后在1447 bp处无条带且第二步PCR后在941 bp处无条带可判为阴性。电泳条带的亮暗表示PCR产物数量的多少，但并不对应于模板的量的多少。样品的电泳结果参照阳性对照和阴性对照组进行判读。4.10 综合判定 符合以下所有特征者判定为克氏原螯虾白斑综合征：DB51/T 30652023 4 临床症状与 4.3 相符；套氏 PCR 扩增结果与 4.9 相符；将套氏 PCR 的第二步 PCR 产物送检测序，序列与附录 A 所列的基因序列进行 blast 比较，同源性达 99%以上。5 预防 5.1 养殖环境 养殖场地应水源充足，排灌方便，水体溶氧量应在4 mg/L

13、以上，pH 7.08.5为宜。环境应符合NY/T 5361的规定，水质应符合GB 11607的规定。5.2 苗种 苗种应体质健壮、规格整齐、无损伤。应就近选苗，外地购苗运输时间应控制在 2 h以内。苗种进场前应先经本文件规定的方法检测阴性后方可引进。放养苗种规格宜为150尾/kg200尾/kg。苗种放养前，应用1%3%氯化钠对苗种进行浸泡，浸泡时间为7min10min。5.3 密度 稻田每亩放养规格为150尾/kg200尾/kg 的苗种30kg40kg，池塘约50kg70kg。5.4 免疫增强剂防控 每年4月至7月，在饲料中添加-葡聚糖、壳聚糖、多种维生素等免疫增强剂，每间隔15天连续投喂5天

14、7天。5.5 微生态防控 每年4月至7月期间，每隔10天15天应使用1次微生物制剂（如:光合菌、芽孢杆菌、EM菌等）调节水质。6 治疗 6.1 外用消毒剂 在疾病流行季节或发病时，用聚维酮碘对养殖水体泼洒消毒，隔天1次，连续泼洒2次。6.2 内服中草药制剂 在疾病流行季节或发病时，按饲料质量1.5%等比添加板蓝根、大蒜素，连续投喂7天。7 病死虾处理 应及时捞出死亡的克氏原螯虾，采用焚毁和掩埋等方法进行无害化处理。对接触病死虾的工具和器皿等，应采用生石灰及时进行消毒杀菌处理。A A DB51/T 30652023 5 附录 A（资料性）白斑综合征病毒基因参考序列 1 ACTACTAACTTCA

15、GCCTATCTAGTAAAACAAGCTAAAAGATTCGACGGAGTTGACCCAGC61 CTTCCCTGCCGCCCTCACCTGCGCTTCTCACCTCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATAC121 AAAGTCATCTTTCATGGACAACATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAA181 GAACATTGAACGATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCA241 CAAGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCAGATAAC

16、GA301 GCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTCCATGGAAGAAATTAGAGC361 CACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTGACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAA421 GATCGATTCTAGAGTAACAGGATCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAAT481 GAGAATGAACTCCAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTC541 TGGCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTG

17、TCAAACCAAATAATGCAAGAAG601 TGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCACCGCCGACGCCAAGGGAAC661 TGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGGCAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGA721 ACTGATCCAGAATGCTCTGCCAAGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCA781 AACTGTCGTGTTTGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGT841 GAACGAACTGGCCGGCAC

18、CATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAAAACACCAA901 GGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATCTAATAATAATGGAGGAGT961 AGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAACATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTC1021 AGAAGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGA1081 AAATGTACCATTCGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAA

19、1141 GGGAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTATCCTCTAC1201 CTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGCTCGAGTTTTCGAAGCCAT1261 CTCTAAGCAAGTAACTGATGCTGAATTCAAGGATATCCTCAACGATATCGAACGTAATAT1321 TTCTTCTGACTATACTAACTGTCCACCAAATACTAACCAAAATGCCTTTGCTCTAGCTAT1381 CAAGAGAGAATTCAGCAGAATTGTTTCCTTCTTAACCATTCTTCGTAAGAACATTACACC1441 CGCATTA F1F2R1R2