DB14807—2013 山羊胚胎移植技术规程.pdf

1、ICS65.020.30B 43DB14山西省地方标准DB 14/8072013山羊胚胎移植技术规程2013-12-20 发布2014-01-20 实施山西省质量技术监督局发 布DB14/8072013I目 次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14胚胎移植材料及人员装备.25胚胎室建设.26供体母羊及种公羊的准备.27供体母羊超数排卵.38受体母羊的准备.39受体母羊同期发情.310胚胎采集与质量鉴定.411胚胎移植.512术后受体羊的管理.6附录 A（规范性附录）试剂、药品、生物制剂和激素.7附录 B（规范性附录）山羊胚胎移植主要仪器、器具及用品.8附录 C（规范性附录）

2、器具的洗涤与灭菌.9附录 D（规范性附录）各种溶液的配制及灭菌.10附录 E（资料性附录）山羊胚胎移植记录表.12附录 F（规范性附录）胚胎质量评定.15DB14/XXXXX2013II前 言本标准按照 GB/T1.1-2009 给出的规则起草。本标准由山西省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：山西省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：罗惠娣、毛杨毅、韩一超、任克良、李俊、张冠武、王志武、周胜花、张丽、赵鹏、薛丽娜。DB14/80720131山羊胚胎移植技术规程1范围本标准规定了山羊胚胎移植的术语和定义、材料及人员装备、胚胎室建设、供体母羊及种公羊的准备、供体母羊超数排卵、受体母羊的

3、准备，受体母羊同期发情、胚胎采集与质量鉴定、胚胎移植及术后受体羊的管理等系列技术操作的基本原则、要求和方法。本标准适用于山西省境内山羊胚胎移植。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 826绵羊羊胚胎移植技术规程NY/T 1674牛羊胚胎质量检测技术规程NY/T 1751羊胚胎移植技术规程NY/T 1900畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1胚胎移植将超数排卵及配种后优种母羊体内的早期胚胎取出或体外获得的早期胚胎

4、移植到同期发情受体母羊子宫或输卵管内，使之继续发育生产出优种羊后代的技术。3.2供体羊能够提供胚胎的优种母羊。3.3受体羊能够接受胚胎的普通母羊。3.4同期发情DB14/XXXXX20132通过外源激素的调控使供体母羊、受体母羊在规定的时间段同时发情的方法。3.5超数排卵在母羊发情周期内，通过外源激素调控，促使卵巢大量卵泡发育并排卵的方法。3.6试情公羊专门用于寻找发情母羊而不进行配种的公羊。试情公羊一般采取带试情布或输卵管结扎、阴茎移位手术的方法防止其配种。4胚胎移植材料及人员装备山羊胚胎移植所需的相关药品、试剂、器具、设备及溶液配制方法、灭菌方法应符合附录A、附录B、附录C、附录D，记录表

5、格见附录E。采胚、检胚、胚胎质量鉴定及胚胎移植人员手臂清洗消毒后穿消毒工作服，戴工作帽、口罩和一次性橡胶手套。5胚胎室建设5.1胚胎室设置胚胎室包括手术室和胚胎操作室，两室之间安装传递窗口。5.2胚胎室要求手术室要宽敞、明亮、洁净、密闭良好、地面硬化，面积不小于35 m2，室内温度为2530，配备有照明灯、紫外线灯、活动手术架、手术器械台及洗手池等，手术前2 h用紫外线照射30 min40 min。胚胎操作室要求密闭良好、无菌、无尘，面积不小于20 m2，室内温度为2530，配备有照明灯、紫外线灯、操作台、体视显微镜、恒温板及恒温培养箱等。6供体母羊及种公羊的准备6.1供体母羊品种优良、系谱档

6、案完整、遗传性能稳定，且个体年龄1.55 周岁产后3 个月以上空怀母羊，体型外貌符合品种标准、生产性能好、膘情中等、繁殖机能正常、无遗传和传染性疾病。6.2种公羊品种优良、系谱档案完整、遗传性能稳定、检疫合格，且个体体型外貌符合品种标准、生产性能良好、体质健壮、性欲旺盛及精液品质好。6.3供体母羊及种公羊的饲养管理6.3.1饲养条件DB14/80720133饲养环境应稳定、安静、卫生、通风、干燥、温度适宜等，避免应激反应。6.3.2饲养管理提供营养平衡的日粮，供体羊和种公羊保持中上等膘情，自由饮水，适当运动。不随意变换草料和管理程序。7供体母羊超数排卵7.1超数排卵的季节根据山西省气候特点和山

7、羊的繁殖特性，最适超数排卵季节为9月上旬至11月下旬。7.2超数排卵的方法7.2.1同期发情超排法用埋植器将 CIDR 放入供体母羊阴道内，放入之日为第 1 d，第 11 d 更换 CIDR，第 1516 d 开始用递减方法连续 4 d 注射 FSH，每天 2 次，间隔 12 h，注射总量 9 mL10 mL(180 mg200 mg)。最后一次注射时取出 CIDR。7.2.2自然发情羊超排法对自然发情的母羊，以发情之日作为发情周期的 0 d，在发情周期的第 1415 d 开始用递减方法连续 4 d 注射 FSH，每天 2 次，间隔 12 h，注射总量 9 mL10 mL(180 mg200

8、mg)。7.3发情鉴定超数排卵处理结束 12 h 后，将试情公羊放入供体母羊群中（试情公羊：母羊=1：30），以母羊站立接受试情公羊爬跨作为发情标准，上、下午各试情一次，每次 1 h 左右，做好发情母羊的标记和记录。7.4配种供体母羊发情后，采用公羊本交或人工授精方法进行配种，每天上、下午各 1 次，共配种 34 次。8受体母羊的准备8.1受体母羊1.55.5 周岁产后 3 个月以上的空怀普通母羊，膘情良好，健康无病、繁殖机能正常。8.2受体母羊饲养管理受体羊单独组群。在胚胎移植实施前 2 个月开始，要加强饲养管理，圈舍要卫生、干燥、通风及环境相对稳定，避免应激反应。9受体母羊同期发情9.1同

9、期发情处理方法受体羊与供体羊同一时间放入 CIDR，取出 CIDR 的时间比供体羊早 8 h9 h，取 CIDR 时肌肉注DB14/XXXXX20134射 PMSG 200 国际单位300 国际单位。9.2受体母羊发情鉴定取出 CIDR 20 h 后，鉴定受体母羊是否发情，鉴定方法同供体母羊。受体母羊与供体母羊发情同期差控制在24 h 之内。在此时间段内，自然发情的母羊也可作为受体羊。鉴定出的发情母羊做好标记和记录。10胚胎采集与质量鉴定10.1术前准备10.1.1停食、剪毛供体羊手术前停食24 h，可自由饮水。手术前一天，将手术部位（乳房前腹中线部或后肢股内侧鼠蹊部10 cm20 cm）的毛

10、剪去并刮掉毛茬。10.1.2麻醉和保定颈静脉注射静松灵0.5 mL1.0 mL将供体羊麻醉后仰放手术架上，再将其四肢固定。10.1.3手术部位消毒手术部位用湿棉纱清洗后覆盖创口巾，然后用碘酒消毒，70%75%酒精脱碘，晾干。10.2手术用手术刀在供体羊手术部位避开血管切开皮肤和皮下结缔组织（切口约5 cm），肌肉组织采用钝性分离法将其分开，腹膜采用食指腹腔内引导手术法切开。然后将食指和中指伸入腹腔，在骨盆腔触摸子宫角，并将子宫、卵巢引出刀口外，观察并记录卵巢排卵情况，对供体母羊进行采胚。10.3采胚10.3.1采胚方法10.3.1.1输卵管法适用于供体羊配种后第3 d的胚胎采集。将采卵硅胶管一

11、端从供体羊一侧输卵管伞部喇叭口插入约2cm并固定，另一端接集胚皿。在同侧宫管结合处，将套管针沿输卵管方向插入，取出针头，连接已吸5mL10 mL冲胚液（37）的注射器，匀力推注射器，使冲胚液依次经输卵管、硅胶管流入集胚皿。用同样方法冲取另一侧输卵管内的胚胎。10.3.1.2子宫法适用于供体羊配种后第68 d的胚胎采集。在供体羊一侧子宫的宫颈结合处，用小镊子扎一个小口，然后把8#10#冲胚三通管头朝子宫角方向插入子宫1.5 cm2.0 cm，用注射器通过冲胚三通管进气口给其气囊充2 mL3 mL空气，冲胚三通管的出水口接培养皿。在同侧子宫的宫管结合处，将套管针插入子宫，取出针头，连接已吸好冲胚液

12、20 mL（37）注射器，匀力推注射器，使冲胚液通过子宫从冲胚三通管出水口流入培养皿。用同样方法冲取另一侧子宫的胚胎。冲胚结束后，用37左右生理盐水将子宫、卵巢、输卵管洗干净，恢复原位。DB14/8072013510.4缝合创口缝合采用两层缝合法，腹膜与肌肉一块做连续缝合，皮肤做结节缝合，针间距1 cm。在肌肉缝合好后，伤口撒适量青霉素粉，再缝合皮肤。缝合完毕，用碘酒消毒创口，肌肉注射PG 2 mL及青霉素160 万单位，然后将羊轻轻从手术架上抬下放到室外，待羊苏醒后赶进羊舍。10.5胚胎质量鉴定将盛有胚胎回收液的培养皿立即送往胚胎操作室，在体视显微镜下，用检胚器迅速检出胚胎，用冲胚液冲洗23

13、 次，移入盛有胚胎保存液的培养皿中。根据胚龄、胚胎形态学及胚胎发育情况将胚胎分为A、B、C、D四个等级，A、B、C级胚胎可用于鲜胚移植。胚胎质量评定方法按附录F执行。11胚胎移植11.1受体羊术前的准备及手术受体羊术前准备和手术方法与供体羊相同。11.2胚胎来源用于移植的胚胎有鲜胚和冷冻胚胎。11.3冷冻胚胎解冻11.3.110%甘油冷冻胚胎解冻程序从液氮罐中取出装有胚胎的细管迅速投入到3235水浴中解冻10 s左右剪去封口端将胚胎推入培养皿中将胚胎依次放入含10%、6%、3%、0%甘油的解冻液各平衡3 min5 min逐步脱甘油或在1 M蔗糖的解冻液中平衡4 min10 min用胚胎保存液洗

14、3 次镜检胚胎质量评定。11.3.21.5M 乙二醇冷冻胚胎解冻程序从液氮罐中取出装有胚胎的细管迅速投入到3235水浴中解冻10 s左右剪去封口端将胚胎推入培养皿中用胚胎保存液洗3 次镜检胚胎质量评定。11.4胚胎移植的原则从供体羊子宫中采集的胚胎移植到受体羊的子宫中去，从供体羊输卵管采集的胚胎移植到受体羊输卵管中去。每只受体羊移植12 枚胚胎，卵巢上无排卵点的受体羊不移植胚胎。11.5胚胎移植的方法11.5.1输卵管内移胚法用移胚器先吸少许空气，再吸少量保存液和12 枚胚胎，最后吸少许空气。在受体羊卵巢有排卵点一侧的输卵管伞部将移胚器针管插入输卵管2 cm左右，轻推移胚器将胚胎推入输卵管内。

15、11.5.2子宫内移胚法吸胚胎方法同11.5.1。在受体羊卵巢有排卵点一侧离宫管结合处2.0 cm2.5 cm的子宫壁上扎一小孔，从此孔将移胚器针管插入子宫腔内，轻推移胚器将胚胎推入子宫。DB14/XXXXX2013612术后受体羊的管理受体羊术后一周内，禁止剧烈运动，注意检查创口愈合情况，一旦感染，应及时处理。移植胚胎的受体羊统一按妊娠母羊进行管理，但要注意观察其胚胎移植后2 个发情周期内是否发情，若发情，应及时配种。DB14/80720137AA附录A（规范性附录）试剂、药品、生物制剂和激素A.1试剂、药品及生物制剂氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、氯化钙（CaCl2）、氯化镁（MgC

16、l2）、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、盐酸、丙酮酸钠、葡萄糖、牛血清白蛋白、犊牛血清、青霉素、链霉素、生理盐水、甘油、蔗糖、洗涤剂、静松灵、0.1%新洁尔灭、碘酒、70%75%酒精等，各种化学试剂均为分析纯，生物制剂及抗生素应符合细胞培养要求，其均在有效期内。A.2激素阴道栓（CIDR）、促滤泡素（FSH）、孕马血清（PMSG）、前列腺素（PG）。DB14/XXXXX20138BB附录B（规范性附录）山羊胚胎移植主要仪器、器具及用品山羊胚胎移植主要仪器、器具及用品见B.1表。表 B.1山羊胚胎移植主要仪器、器具及用品表名称数量名称数量放栓枪3 把一次性创口巾5 包体

17、视显微镜2 台手术刀3 把保温板2 个手术剪6 把培养箱1 台细管剪2 把活动手术架6 台敷料5 包手术灯3 个平镊6 把活动手术器械车4 台鼠齿镊6 把紫外线灯6 个止血钳10 把高压灭菌仪1 台持针器3 把干燥箱1 台缝针2 包天平（万分之一）1 台缝线5 包超净工作台1 台套管针5 个超纯水仪1 台冲胚管(8 g3cc、10 g3cc)5 个磁力搅拌器1 个硅胶管5 个酸度计1 个培养皿（35 mm、100 mm）各 30 个水浴锅1 台检胚器、移胚器各 5 个超声波清洗仪1 台注射器（2 mL、5 mL、10 mL、20 mL）各 30 个液氮罐（10 L、3 L）各 1 个温度计3

18、支烧杯（500 mL、250 mL、100 mL）各 5 个记号笔3 支量筒（100 mL、50 mL、25 mL）各 2 个纱布1 包定量瓶（500 mL、100 mL、50 mL）各 2 个碘酒棉球、酒精棉球各 3 广口瓶试剂瓶（50 mL、100 mL、500 mL）各 10 个工作服、工作帽、口罩12 套玻璃棒5 个橡胶手套（一次性）50 副滤膜过滤器（0.22 m、0.45 m）各 20 个PE 手套（一次性）100 副剪毛剪3 把脸盆3 个刮毛刀3 把毛巾、肥皂各 3 块DB14/80720139CC附录C（规范性附录）器具的洗涤与灭菌C.1器具洗涤C.1.1浸泡新购置的玻璃器皿使

19、用前应先用自来水刷洗，然后用5%稀盐酸溶液浸泡12 h以上。使用后的玻璃器皿立即浸入清水中。C.1.2刷洗浸泡后玻璃器皿在洗涤剂水中用毛刷洗刷，洗刷时要防死角，或者在超声波清洗仪的洗涤剂水中洗涤20 min30 min。金属器械在洗涤剂水中刷洗干净。C.1.3冲洗刷洗的玻璃器皿和金属器械用自来水反复冲洗，直至洗涤剂冲洗干净，然后用超纯水（阻值16M以上）涮洗23 次，晾干备用。C.1.4其他经灭菌后密封包装的一次性使用的塑料器皿和塑料注射器，打开包装即可使用。冲胚管、硅胶管、套管针、检胚器、移胚器等使用后立即用超纯水（阻值16M以上）冲洗干净，晾干备用。C.2手术室、胚胎操作室及器具消毒灭菌C

20、2.1紫外线灭菌法手术室、胚胎操作室、操作台表面、工作服、塑料器皿和一些不能使用其它方法进行消毒灭菌的物品采用紫外线消毒灭菌。塑料制品放在距紫外线灯50 cm80 cm处，使每平方米厘米有0.06 W能量的照射，照射时间30 min40 min。C.2.2干热灭菌法耐高温的玻璃和金属器具，包装好后放入烘干箱内，160处理40 min60 min，待恢复常温取出。C.2.3高压、湿热灭菌法适用于玻璃器皿、金属器具以及耐压耐热的塑料制品，包装好后放入高压灭菌器内，120（0.105Mpa）灭菌15 min20 min。C.2.4酒精浸泡灭菌法冲胚管、硅胶管、套管针、检胚器、移胚器等用70%75%

21、酒精浸泡消毒灭菌40 min60 min，然后用生理盐水冲洗干净，使用前用冲胚液涮洗2 次。DB14/XXXXX201310DD附录D（规范性附录）各种溶液的配制及灭菌D.1PBS液配制及灭菌PBS液配制及灭菌见D.1 表、D.2 表。表 D.1PBS 液配制及灭菌成分分子量组分浓度（mM）含量（g/L）备注氯化钠（NaCl）58.441378.0氯化钾（KCl）74.552.70.2氯化钙（CaCl2）147.020.680.1氯化镁（MgCl2或MgCl2.6H2O）95.21或203.30.50.05或0.1磷酸二氢钾(KH2PO4)136.091.470.2磷 酸 氢 二 钠(Na2H

22、PO4 或 Na2HPO4.7H2O 或Na2HPO4.12H2O)142.0或268.0或358.08.091.15 或 2.16 或2.90配制方法：1.称上述化学试剂置于1 L烧杯中。2.向烧杯中加入约800 mL的超纯水（阻值16M18M），充分搅拌溶解。3.用盐酸将PH值调节至7.27.6，然后加入超纯水（阻值16M18M）定溶至1 L。4.高温（120）高压（0.105Mpa）灭菌20 min30 min，4保存。使用进口成品PBS粉剂配制方法，根据产品使用说明书。表 D.2A 液和 B 液的配制名称含量（g）含量（g）含量（g）备注A液100 mL500 mL1 000 mL为了

23、便于保存，可配制成A液和B液，也可配制成浓缩10倍的原液。A、B 原液高压灭菌后 4保存。氯化钠（NaCl）8.040.080.0氯化钾（KCl）0.21.02.0氯化钙（CaCl2）0.10.51.0氯化镁（MgCl2或MgCl2.6H2O）0.05或0.10.25或0.50.5或1.0B液100 mL500 mL1 000 mL磷酸二氢钾(KH2PO4)0.21.02.0磷酸氢二钠(Na2HPO4或Na2HPO4.7H2O)1.15或2.165.75或10.811.5或21.6DB14/807201311D.2冲胚液的配制及灭菌取丙酮酸钠0.036 g、葡萄糖1.0 g、牛血清白蛋白3.0

24、 g4.0 g或犊牛血清10 mL20 mL、青霉素100国际单位/ml、链霉素100国际单位/ml加入到PBS液中至1 L，充分混匀后，用0.22 m滤膜过滤器过滤灭菌。D.3胚胎保存液的配制及灭菌取犊牛血清2 mL,PBS液8 mL，青、链霉素各100国际单位/ml，混匀后用0.22 m滤膜过滤器过滤灭菌。D.4胚胎解冻液配制及灭菌D.4.110%甘油解冻液取含20%犊牛血清的保存液9.0 mL，加入1.0 mL甘油，混匀后用0.22 m滤膜过滤器过滤灭菌。D.4.21M、0.3M蔗糖解冻液用保存液分别配制含1 M、0.3 M蔗糖的胚胎解冻液，0.22 m滤膜过滤器过滤灭菌。D.4.36%

25、3%甘油的蔗糖解冻液取0.3M蔗糖的胚胎解冻液2 mL、3.5 mL，分别加入10%甘油解冻保护液3 mL、1.5 mL，即配成含6%、3%甘油的蔗糖解冻液，混合均匀，用0.22 m滤膜过滤器过滤灭菌。DB14/XXXXX201312EE附录E（资料性附录）山羊胚胎移植记录表山羊胚胎移植记录见E.1表、E.2表、E.3表、E.4表。表 E.1供体羊超数排卵及配种记录表年月日供体羊号品种年龄胎次CIDR生产厂家、批号FSH生产厂家、批号放CIDR时间换CIDR时间撤CIDR时间注射FSH日期月日月日月日月日备注：超排人员：早晚早晚早晚早晚时 分FSH剂量每天剂量总剂量配种人员：发情时间发情结束

26、时间持续时间配种时间第一次第二次第三次配种公羊号地点DB14/807201313表 E.2胚胎采集记录表年月日供体羊号采胚日期采胚开始时间采胚结束时间左侧卵巢右侧卵巢卵泡数黄体数卵泡数黄体数胚胎质量A 级B 级C 级胚胎质量A 级B 级C 级桑椹胚桑椹胚致密桑椹胚致密桑椹胚早期囊胚早期囊胚囊胚囊胚扩张囊胚扩张囊胚孵化囊胚孵化囊胚合计合计采胚总数A 级B 级C 级备注采胚人员：检胚人员：参加人员：地点：表 E.3受体羊同期发情处理记录表年月日受体羊号品种年龄CIDR 批号放 CIDR 时间撤 CIDR 时间PMSG 厂家、批号PMSG 注射时间PMSG剂量发情日期备注同期发情处理人员：发情鉴定人

27、员：地点：DB14/XXXXX201314表 E.4受体羊胚胎移植记录表年月日受体羊号品种年龄发情日期移植时间卵巢黄体、红体数（左/右）卵泡数（左/右）子宫或输卵管移植（左/右）胚胎移植数量供胚羊号鲜胚或冻胚胚胎解冻方法胚胎发育阶段及等级返情日期产羔日期产羔数备注胚胎移植人员：检胚人员：参加人员：地点：DB14/807201315FF附录F（规范性附录）胚胎质量评定F.1胚胎质量检测方法F.1.1胚胎的形态学检测借助于显微镜对胚胎发育阶段和发育状况进行形态学观察。F.1.2胚胎的体外发育能力检测将胚胎（鲜胚或解冻胚胎）在3839、5%CO2的相对饱和湿度的培养箱中体外培养24 h48 h观察胚

28、胎存活情况和发育状况。F.2胚胎发育阶段卵子受精后随着日龄的增加，胚胎发育阶段也不同。所以，胚胎的质量评定，要考虑到胚龄。通常以母畜发情日为0 d来计算，距发情日的天数即为胚龄，胚胎的正常发育阶段应与胚龄相一致。F.2.13 d前输卵管采集胚胎正常发育状态28 细胞。F.2.26 d9 d子宫采集胚胎正常发育状态F.2.2.1桑椹胚可观察到球状的细胞团，细胞团占透明带内腔50%60%。F.2.2.2致密桑椹胚卵裂球细胞进一步分裂变小，细胞团占透明带内腔60%70%。F.2.2.3早期囊胚内细胞团的一部分出现囊胚腔，但难以分清内细胞团和滋养层，细胞团占透明带内腔70%80%。F.2.2.4囊胚内

29、细胞团和滋养层界限清楚，囊胚腔明显，细胞充满透明带内腔。F.2.2.5扩张囊胚囊胚腔体积增大到原来的1.21.5 倍，透明带变薄。F.2.2.6孵化囊胚囊胚腔继续扩大，透明带破裂，细胞团脱出。DB14/XXXXX201316F.3胚胎的分级在一定胚龄期，根据胚胎的形态学及发育程度将胚胎分为A、B、C、D四个等级。见图F.1、F2。A级胚胎发育阶段与胚龄一致。胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，胚胎细胞团呈均匀对称的球形，透明带光滑完整，厚度适中，不规则的细胞相对较少，变性细胞不高于15%。B级胚胎发育阶段与胚龄基本一致。胚胎形态完整，轮廓清晰，色调、透明度及细胞密度良好，透明带光滑完整，厚度适中，存在一定数量大小和形状不规则的细胞或细胞团，但变性细胞不高于50%。C级胚胎发育阶段与胚龄不太一致。胚胎轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞较多，但变性细胞不高于75%。D级胚胎发育阶段与胚龄不一致。包括退化胚胎、变性胚胎及未受精卵。胚胎轮廓不清晰，甚至形态不完整，内细胞团有较多碎片，结构松散，游离的细胞多，变性细胞高于75%。图 F.1早期胚胎正常发育状态图图 F.2胚胎质量评定示意图(左侧变性胚胎，右侧正常胚胎)_