DB15 T 4172-2025 牛呼吸道疾病综合征诊断技术规范.pdf

1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 41722025 牛呼吸道疾病综合征诊断技术规范 Technical specification for the diagnosis of bovine respiratory disease complex 2025-08-29 发布2025-09-29 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 41722025 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

2、本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心、兴安盟动物疫病预防控制中心、北京生泰尔科技股份有限公司、北京华夏兴洋生物科技有限公司、金宇保灵生物药品有限公司。本文件主要起草人：徐晓静、谢梦圆、张勇、吕亮亮、王秀敏、赵卓、付婧。DB15/T 41722025 1 牛呼吸道疾病综合征诊断技术规范 1 范围 本文件规定了牛呼吸道疾病综合征的临床诊断和实验室诊断技术方法。本文件适用于养牛场（户）和动物诊疗单位对牛呼吸道疾病综合征的诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条

3、款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18637 牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范GB 19489 实验室 生物安全通用要求NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T 575牛传染性鼻气管炎诊断技术NY/T 3234 牛支原体PCR检测方法DB15/T 2907溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范中国药典 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。BRSV：牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus）B

4、T 细胞：牛鼻甲骨细胞（Bovine turbinate cell）BPIV-3：牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3）BVDV：牛病毒性腹泻/黏膜病毒（Bovine viral diarrhea/mucosal disease virus）ELISA：酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay)Hs：昏睡嗜血杆菌（Haemophilus somnus）IBRV：牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus）MDBK细胞：牛肾细胞（Madin dar

5、by bovine kidney cell）Mh：溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）M.Bovis：牛支原体（Mycoplasma bovis）Pm：多杀性巴氏杆菌（Pasteurellar multocida）PBS：磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline)TSA 培养基：肉汤大豆胨琼脂培养基(Tryptone soy agar)DB15/T 41722025 2 Vero细胞：非洲绿猴肾细胞（Verda reno cell）5 诊断 临床诊断 5.1.1 流行病学 不同年龄和品种牛均可感染，犊牛易感，牛呼吸道合胞体病毒病多发于15月龄犊

6、牛，牛传染性鼻气管炎多发于2060日龄犊牛，牛病毒性腹泻/黏膜病多发于618月龄牛；牛副流感、多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌病各个年龄阶段牛均易感，昏睡嗜血杆菌病多发于12月龄以内牛。一年四季均可发病，以冷热交替、气候剧变、闷热、潮湿、多雨的时候易发，其中牛呼吸道合胞体病毒病和昏睡嗜血杆菌病多发于冬季，呈散发性。病牛和隐性感染牛是本病传染源，常通过空气、飞沫和接触传播。5.1.2 临床症状 5.1.2.1 牛传染性鼻气管炎 病初高热达39.5 42，精神沉郁、拒食、咳嗽、流泪，流黏稠鼻液，鼻黏膜充血，轻度溃疡，鼻镜因炎症反应呈红色，通常称为“红鼻子病”。常因炎性渗出物阻塞鼻孔引起呼吸困难，呼

7、吸频率加快，呼气中有臭味。严重者数小时内可死亡。5.1.2.2 牛病毒性腹泻/黏膜病 突然发病，体温升至40 42。病牛精神沉郁、厌食，鼻、眼有浆液性分泌物，2 d3 d内鼻镜及口腔黏膜可能发生糜烂，流涎增多、呼气恶臭，通常在口腔受损后发生严重腹泻，病初水样腹泻，后期腹泻物带黏液和血液。部分病牛出现蹄叶炎及趾间皮肤糜烂和溃疡，导致跛行。母牛妊娠期感染可引起流产，或产先天性缺陷犊牛。5.1.2.3 牛呼吸道合胞体病毒病 感染初期一般不表现临床症状或仅表现轻微症状，如精神沉郁、厌食、咳嗽、流鼻液，呼吸频率增加，呼吸音异常，肺音刺耳，口、鼻、眼分泌物大量增加；重症牛呼吸困难，腹式呼吸，有的严重腹泻。

8、严重者易死亡。5.1.2.4 牛副流感 病牛体温升高可达41，鼻镜干燥，继而流黏脓性鼻液，流泪，可见结膜炎，呼吸困难，咳嗽，有时张口呼吸，睡眠时有呼噜声。5.1.2.5 牛支原体肺炎 发病牛表现轻度至重度呼吸困难，病初伴有高热，病程长，机体逐渐消瘦，最后呼吸衰竭和消瘦死亡。部分发病犊牛可出现四肢关节（前肢腕关节、后肢跗关节和膝关节）逐渐肿大和跛行症状。成年母牛可引起乳腺炎，乳房肿大，质度硬实。5.1.2.6 牛多杀性巴氏杆菌病 DB15/T 41722025 3 急性败血型：病牛初期体温可高达41 42，精神沉郁、反应迟钝、肌肉震颤，呼吸、脉搏加快，眼结膜潮红，食欲废绝，反刍停止。病牛表现为腹

9、痛，常回头观腹，粪便初为粥样，后呈液状，并混杂黏液或血液且恶臭。一般病程为12 h36 h。浮肿型：除表现全身症状外，特征症状是颌下、喉部肿胀，有时水肿蔓延到垂肉、胸腹部、四肢等处。眼红肿、流泪，有急性结膜炎。呼吸困难，皮肤和黏膜发绀、呈紫色至青紫色，常因窒息而死。肺炎型：主要表现纤维素性胸膜肺炎症状。病牛体温升高，呼吸困难，初期流泡沫状鼻液，后期鼻液黏稠。胸部叩诊呈浊音，有疼感。肺部听诊有支气管呼吸音及水泡性杂音。眼结膜潮红，流泪。有的病牛会排带有黏液和血块的稀便。本病型最为常见，病程一般为3 d7 d。5.1.2.7 牛溶血性曼氏杆菌病 发病牛呼吸困难、张口呼吸，呼吸伴有啰音，从鼻孔和口腔

10、流出大量白色泡沫样液体，体温升高可达40 42，精神沉郁、厌食，后期卧地不起，呼吸极度困难，最后窒息而死，病程3 d7 d。5.1.2.8 牛昏睡嗜血杆菌病 病牛初期精神沉郁，嗜睡，运动失调，蹒跚，呼吸困难，后期四肢瘫痪，昏迷，卧地，严重者甚至死亡。5.1.3 病理变化 5.1.3.1 牛传染性鼻气管炎 病牛呼吸道黏膜轻度溃疡，黏膜面被覆腐臭黏稠渗出物。部分病例见肺间质水肿，一般不发生肺炎病变。口腔颊黏膜、唇、齿龈和硬腭黏膜见溃疡，溃疡病变还可见于食道、前胃、真胃黏膜，卡他性肠炎。特征性组织病理变化是非化脓性脑炎，神经胶质细胞增生和淋巴细胞性套管，主要见于三叉神经节炎和延髓感觉神经通路。5.1

11、3.2 牛病毒性腹泻/黏膜病 整个口腔黏膜见大小不等的糜烂和溃疡灶。呼吸道黏膜肿胀、出血，伴有炎症渗出物和黏膜坏死。典型病变是食管黏膜糜烂和溃疡灶呈纵行排列。胃黏膜出血、糜烂、溃疡或结痂。小肠黏膜肿胀、出血。肠系膜淋巴结肿胀、充血、出血和水肿。5.1.3.3 牛呼吸道合胞体病毒病 呼吸道黏膜充血，支气管、细支气管充满黏稠的渗出液，伴有水肿、出血。典型的间质性肺炎，肺尖叶、心叶及隔叶出现小叶性或大叶性暗红色实变，质如有光泽的肌肉。其它组织表面可能见出血斑点。特征性组织病理学变化是肺组织各级细支气管腔内可见合胞体细胞，同时在细支气管上皮细胞浆内见大小不等的圆形或椭圆形的嗜酸性包涵体，有的病例在肺

12、泡腔内可见透明膜形成。5.1.3.4 牛副流感 肺脏表面见斑片状或融合性紫红色或灰色实变病灶，或不规则小叶性肺不张病灶，病变通常局限于肺的颅腹侧区域。5.1.3.5 牛支原体肺炎 支气管性间质性肺炎和支气管性间质性化脓性肺炎。肺炎病变多发于前叶和中叶，两侧对称，严重病例炎症累及到膈叶，使多数肺组织实变。支气管性间质性肺炎的炎区呈深红色有光泽的肌肉样实变。DB15/T 41722025 4 慢性支气管间质性化脓性肺炎在是支气管性间质性肺炎病变的基础上发展而来，在肺实变区散在或弥漫分布针尖大小至粟粒大小的结节状的黄白色脓肿。后期脓肿干燥、易碎和从肺胸膜或切口表面隆起。有的病例可见肺炎区与腔壁胸膜粘

13、连。5.1.3.6 牛多杀性巴氏杆菌病 败血型：主要呈全身性急性败血症变化和咽喉部急性炎性水肿。浮肿型：咽喉部或颈部皮下水肿，浆液渗出，呈淡黄色胶冻样，切开流出淡黄色液体，有时伴有出血，可累及咽周围组织；咽和颈前淋巴结高度肿胀；上呼吸道黏膜潮红。肺炎型：主要表现浆液纤维素性胸膜肺炎，胸腔内有大量浆液性纤维素性渗出物。肺炎区质度变实，切面肺小叶呈暗红色，肺小叶间质水肿而增宽呈灰白或黄白色胶冻样，淋巴管扩张，使肺切面呈红白相间的大理石样纹理；组织学上表现典型的纤维素性肺炎病变，肺充血、水肿和出血，肺泡腔内充满粉红色丝网状的纤维素性渗出物和或多或少的中性粒细胞。随着病程进一步发展，可出现坏死灶，呈污

14、灰色或暗褐色，通常无光泽；有的病例可见纤维素性心包炎和腹膜炎，心包与胸膜黏连。其它组织器官可出现出血斑点。5.1.3.7 牛溶血性曼氏杆菌病 特征性病变为浆液纤维素性胸膜肺炎，与牛多杀性巴氏杆菌病肺脏病变相似。其它组织器官无特征性病理变化。5.1.3.8 牛昏睡嗜血杆菌病 上呼吸道感染引起喉头炎和气管炎，下呼吸道感染引起纤维素性化脓性肺炎，有的病例病变可累及胸膜。淋巴结肿大呈黑红色。大脑见多发性出血性坏死灶，局部浆膜和肌肉广泛出血。实验室诊断 5.2.1 主要仪器设备 恒温培养箱（37 2）、CO2细胞培养箱（37 2）、倒置显微镜、电子显微镜、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、微量可

15、调移液器（规格100 L1000 L、20 L200 L、1 L20 L）、高速台式冷冻离心机（4，离心速度12000 r/min以上）。5.2.2 主要试剂 除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNase污染的容器分装。TSA 培养基、细菌微量生化反应管及指示剂、PBS（0.01 moL/L，pH7.2）、DEPC水、Taq酶、DNA Marker（DL 500、DL 2000）。5.2.3 样品采集 样品的采集按照NY/T 541的规定进行。样品处理的生物安全措施符合GB 19489的规定。优先采集未治疗的新发病动物样品。鼻腔采样，将无菌棉拭子伸入鼻腔内刮取黏液，放入装

16、有PBS的离心管。编号并记录相关信息。病死牛取气管、支气管、肺、关节液等组织样品，置于采样杯内。样品冷藏运输。5.2.4 样品处理 DB15/T 41722025 5 将 PBS 离心管中采集的鼻拭子样品充分振荡，4、12000 r/min离心5 min，取上清编号备用；组织样品称取1 g置于研钵，充分研磨后加5 mL PBS，混匀，4、12000 r/min离心5 min，取上清编号备用，-70 保存，或直接接种细胞。5.2.5 病原检测 5.2.5.1 病毒检测 5.2.5.1.1 电镜检查 将采集的样品用PBS制成1:4悬液，装入盛有玻璃珠的管内充分震荡30 min50 min，取悬液3

17、000 r/min离心30 min，取上清，15000 r/min离心30 min，取上清，再以40000 r/min50000 r/min离心3 h5 h，弃上清，加12滴蒸馏水悬浮管内沉淀，2%磷钨酸染色，电镜下观察病毒粒子形态。牛传染性鼻气管炎病毒电镜下可见外围成球形、直径约200 nm的病毒颗粒，牛呼吸道合胞体病毒电镜下可见直径约100 nm150 nm，表面有刺突的病毒颗粒，牛病毒性腹泻病毒粒子呈球形，直径约60 nm，牛副流感病毒3型电镜下呈不规则型，直径约200 nm。5.2.5.1.2 病毒分离鉴定 将处理的样品接种适宜细胞（MDBK细胞、Vero细胞、BT 细胞）进行病毒分离

18、培养，应用标准血清进行中和试验，对病毒进行鉴定。5.2.5.1.3 免疫荧光染色 应用相应的病毒抗体对细胞培养物进行免疫荧光检测。根据荧光信号强弱判定结果。5.2.5.1.4 PCR 检测 按照GB/T 18637中方法检测牛病毒性腹泻/黏膜病毒；按照NY/T 575中方法检测牛传染性鼻气管炎病毒；参考文献 1 中方法检测牛呼吸道合胞体病毒，反应体系：荧光PCR酶10 L，上、下游引物（10 mol/L）各0.8 L，模板2 L，ROX Reference Dye 0.4 L，DEPC 水6 L，反应程序：95 30 s；95 5 s；55 34 s，40个循环；参考DB 15/T 2906

19、中方法检测牛副流感病毒3型（引物序列均见附录A中表A.1）。5.2.5.1.5 ELISA 检测 应用ELISA试剂盒，按照说明书进行。5.2.5.1.6 胶体金试纸条检测 应用商品化试剂盒，按照说明书进行。5.2.5.2 细菌检测 5.2.5.2.1 染色镜检 将采集的样品进行革兰染色镜检。Pm染色后，镜下呈两极浓染的短杆菌，散在分布；Mh、Hs镜检均可见粉红色的短杆菌。5.2.5.2.2 细菌培养 将采集的鼻拭子或组织样品，用相应细菌培养基培养24 h48 h。DB15/T 41722025 6 Pm和Mh用血琼脂培养基或TSA培养基培养，Pm可见光滑、湿润、灰白色、露珠状、不溶血的菌落；

20、Mh 可见圆形、光滑、湿润并伴有溶血现象的菌落。Hs用含有血和酵母提取物的脑心汤琼脂培养，可见圆形隆起、湿润闪光的淡黄色或奶油色菌落。5.2.5.2.3 生化鉴定 将分离纯化的菌用相应的生化鉴定管进行生化特性鉴定，根据伯杰细菌手册统计结果。5.2.5.2.4 分子检测 参考文献 2中方法进行检测，25 L反应体系的配制：多杀性巴氏杆菌上下游引物各0.5 L，探针0.75 L；溶血性曼氏杆菌上下游引物各0.25 L，探针0.25 L；昏睡嗜血杆菌上下游引物0.3 L，探针0.3 L；荧光PCR酶12.5 L；DNA 模板5 L；DEPC水4.1 L。反应程序为95 5 min；95 15 s；6

21、0 30 s，45个循环。或按照DB15/T 2907中方法检测溶血性曼氏杆菌（引物序列均见附录A中表 A.2）。5.2.5.3 支原体检测 5.2.5.3.1 分离培养 将样品加入支原体液体培养基中，置37、5%CO2 培养箱中培养3 d5 d，当培养基颜色由红色变为黄色时，进行盲传并接种到支原体固体培养基培养3 d5 d。当观察到有菌落生长时，挑取单个菌落接种到支原体液体培养基，如此交替培养重复3次或次，进行纯化。固体培养基上可生长出典型的“煎蛋样”的针尖大小透明菌落。5.2.5.3.2 染色镜检 挑取特征性单个菌落进行姬姆萨染色，镜下可见蓝紫色球形颗粒状培养物；用支原体染色液进行染色，镜

22、下呈蓝色颗粒状菌落。5.2.5.3.3 生化鉴定 将符合镜检结果的支原体菌落根据中国药典进行生化检测及结果判定。5.2.5.3.4 分子生物学检测 按照NY/T 3234检测支原体（引物序列见附录A中表A.3）。6 综合判定 疑似 符合5.1.2、5.1.3的临床症状和病理变化，可初步判定为牛呼吸道疾病综合征疑似病例。确诊 符合 5.1.2，5.1.3 和 5.2.5.1、5.2.5.2、5.2.5.3 其中任一检测结果为阳性可判定为牛呼吸道疾病综合征。DB15/T 41722025 7 A A 附录A （资料性）PCR 引物 A.1 IBRV、BVDV、BPIV-3 和 BRSV 引物序列见

23、表 A.1。表A.1 IBRV、BVDV、BPIV-3 和 BRSV 引物序列 引物名称 引物序列 IBRV-F TGTGGACCTAAACCTCACGGT IBRV-R GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC IBRV-P AGGACCGCGAGTTCTTGCCGC BVDV-F CCGCGAMGGCCGAAAAGA BVDV-R TGACGACTNCCCTGTACTCAG BVDV-P CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA BPIV-3-F CTGGAGTTATGCGATGGGTGT BPIV-3-R TGTCGTTTGCGATGTTGGTT BRSV-F AGTTGACAC

24、TGTATCCGTTGG BRSV-R ACTCATCGGAAGGAAACA A.2 Pm、Mh 和 Hs 引物序列见表 A.2。DB15/T 41722025 8 表A.2 Pm、Mh 和 Hs 引物序列 引物名称 引物序列 Pm-F CTATCCGCTATTTACCCAGTG Pm-R ACGAGCCATAAAATAATGCCAT Pm-P TGCGAATGAACCGATTGCCGC Mh-F TTGCTCTAACGCTCGCTTG Mh-R GGACTGGATTTCAGTTTCTCC Mh-P ATCAACCACGGCTTGTTGGAATGC Hs-F CTGATCGATTGGGTACA

25、GATTC Hs-R GCGTTTTACCATATCCAATAGC Hs-P CTTGGATCTTTCTCAACGCCGAGC A.3 M.Bovis 引物序列见表 A.3。表A.3 M.Bovis 引物序列 引物名称 引物序列 M.Bovis-F TTTTAGCTCTTTTTGAACAAAT M.Bovis-R GGCTCTCATTAAGAATGTC DB15/T 41722025 9 参考文献 1 基于牛呼吸道合胞体病毒 F 基因 TB Green 荧光定量 PCR 检测方法的建立J.中国兽医学报,2023,43(04):648-653.（DOI:10.16303/ki.1005-4545.2023.04.02）2牛呼吸道主要细菌性病原四重荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用D.内蒙古农业大学,2023.（DOI:10.27229/ki.gnmnu.2023.000840.）