DB15 T 4195-2025 牛结节性皮肤病样品采集技术规范.pdf

1、 ICS 11.220 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 41952025 牛结节性皮肤病样品采集技术规范 Technical Specifications for Sample Collection of Lumpy Skin Disease 2025-09-30 发布2025-10-30 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 41952025 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。

2、本文件起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、金宇保灵生物药品有限公司、呼伦贝尔市动物疫病预防控制中心、阿拉善盟动物疫病预防控制中心、鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心、巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：郭宇、王旭红、王建龙、萨茹拉、张璇、刘然、特木尔巴根、狄栋栋、苏胜杰、武琥琮、王巍、郭少平、杨波、刘海成、郭文。DB15/T 41952025 1 牛结节性皮肤病采样技术规范 1 范围 本文件规定了牛结节性皮肤病样品采集、保存、运输及废弃物处置等技术规范和要求。本文件适用于牛结节性皮肤病的检测、诊断、监测、免疫效果评价等兽医实验室样品采集工作。2 规范性引用文件 下列文件中的内

3、容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。样品 specimen 取自牛或环境，拟通过检验反映牛个体、群体或环境有关状况的材料或物品。采样 sampling 按照规定的程序和要求从牛或周围环境取得一定量样本，并经过处理作为检测用样品的过程。灭菌 sterilization 采用物理或化学方法杀灭或清除所有微生物的方法。废弃物 hazardous waste 有潜在生物危险、可燃、易燃

4、腐蚀、有毒和有感染风险的对人、环境有害的一切废弃物。4 采样前准备 采样器材 DB15/T 41952025 2 4.1.1 器械：解剖刀、手术剪刀、镊子、采血器、针头。4.1.2 容器：真空采血管（含 EDTA 或肝素钠抗凝剂）、离心管（1.5 mL、2 mL）、样品保存管、样品保存盒（袋）。4.1.3 其他：医用棉签、75%酒精棉球、碘酊棉球、封口膜、冰袋、试管架、样品运输箱。防护用品 一次性口罩、防护服、手套、鞋套、护目镜、面罩。记录用品 中性笔、记号笔、防水标签纸、采样表等。样品保存液 4.4.1 0.1 mol/L PBS(pH7.4)缓冲液，配制方法见附录 A 中的 A.1。4.

5、4.2 10%甘油-PBS 缓冲液，配制方法见附录 A 中的 A.2。5 样品的采集与处理 基本原则 5.1.1 病毒分离和核酸检测时，优先采集皮肤结节（痂皮）、淋巴结、肺、脾等组织上的病变结节及周围组织和口鼻拭子等样品，在牛急性感染期可采集抗凝血进行检测；抗体检测时，优先采集血清样品。5.1.2 样品采集、前处理、制备时要做好个人生物安全防护，避免交叉污染，具体按照 GB 19489 的规定执行。5.1.3 解剖刀、手术剪刀、镊子使用前应经 121 高压蒸汽或煮沸 30 min 灭菌处理，临用时可用 75%酒精擦拭或经火焰灭菌处理。5.1.4 采样后的废弃物等按照医疗废物管理条例进行无害化处

6、理。血样 5.2.1 血样的采集 5.2.1.1 采血前准备 采血前应对采血部位的皮肤剃毛，用1%2%碘酊消毒后，再用75%的酒精棉球由内向外螺旋式脱碘消毒，干燥后采血。采血时可用采血器或真空采血管。5.2.1.2 尾静脉采血 将牛尾提起，在离尾根大约10 cm中间凹陷处，垂直刺入采血器针头约1 cm，见有回流血液时，随即向外拉针芯使血液流入采血器或接入真空采血管，采血后立即用棉球按压止血，止血后用碘伏棉球对采血部位消毒。5.2.1.3 颈静脉采血 在采血部位下方用手压迫颈静脉血管，使其怒张后使针头与皮肤呈45角由下向上方刺入血管，见血液回流时，随即向外拉针芯使血液流入采血器或接入真空采血管，

7、采血后立即用棉球按压止血，止血后用75%的酒精棉球对采血部位消毒。DB15/T 41952025 3 5.2.2 血样的处理 5.2.2.1 全血样品 采集不少于3 mL的血液样品到含EDTA或肝素钠抗凝剂的真空采血管中，采血后要轻轻上下颠倒，使抗凝剂与血液充分混合。5.2.2.2 血清样品 采集不少于5 mL的血液样品，将装有血液的采血器在室温下静置2 h4 h，待血液凝固析出血清后置于4 冰箱过夜，用移液器无菌吸出血清至1.5 mL离心管内；急用时可采用低速离心机(1000 g离心10 min15 min)分离血清。皮肤结节和痂皮 5.3.1 先用 0.1 mol/L PBS(pH 7.4

8、)缓冲液清洗皮肤表面，再用无菌手术剪刀取 2 g5 g 结节，放入样品保存管内，加入 10%甘油-PBS 保存液，并没过样品，加盖密封，-20 冷冻保存。5.3.2 用手术剪刀取 2 g5 g 痂皮和周围组织病料，放入样品保存管内，加入 10%甘油-PBS 保存液并淹没全部样品，加盖密封，-20 冷冻保存。口腔/鼻腔拭子 取无菌医用棉签插于牛口腔和鼻腔，轻轻擦拭并慢慢旋转23圈沾取鼻腔分泌物，拭子取出后立即放入2 mL离心管中，加入0.1 mol/L PBS(pH7.4)缓冲液或10%甘油-PBS保存液，加盖密封，-20 冷冻保存。组织样品 5.5.1 病死牛在剖检时，可采集淋巴结、肺、脾等组

9、织的病变结节及周围组织 2 g5 g，放入样品保存管内，加入 10%甘油-PBS 保存液，并没过样品，加盖密封，-20 冷冻保存。5.5.2 临床健康牛，可在屠宰时采集淋巴结、疑似结节组织样品 2 g5 g，放入样品保存管内，加入10%甘油-PBS 保存液，并没过样品，加盖密封，-20 冷冻保存。环境样品 5.6.1 可采集牛圈中的垫料、粪便或尿液 2 g5 g，放入样品保存管内，加盖密封，-20 冷冻保存。5.6.2 可采集饲料槽、饮水槽的拭子样品，放入 2 mL 离心管中，加入 0.1 mol/L PBS(pH7.4)缓冲液或 10%甘油-PBS 保存液，密封后-20 冷冻保存。媒介样品

10、5.7.1 在牛耳部、颈部、腋窝、腹股沟、尾巴等部位采集牛身上的蚊、蝇、蜱等媒介样品，尽量保证样品的完整性，放入装有 70%乙醇的样本保存管内，加盖密封，-20 冷冻保存。5.7.2 在牛舍、挤奶厅、饮水处、活动场地周围悬挂捕蝇笼或放置粘蝇纸（带、板），放置 24 h48 h 后，将捕蝇笼或粘蝇纸（带、板）上的蚊、蝇等媒介样品取下放入样本保存管中，-20 冷冻保存。6 样品的标记与包装 在装有样品的离心管盖和管壁上用记号笔标记样品的编号，标记的样品编号按照采样顺序编写，并与采样单填写的编号一致。DB15/T 41952025 4 皮肤结节、痂皮、组织、环境、媒介等样品应置于特定的样品盒（袋）内

11、注明采样场点、采样时间、样品名称、数量、编号等。口鼻拭子、血清等样品装于离心管中，应置于特定的样品盒（袋）内，注明采样场点、采样时间、样品名称、数量、编号等。抗凝血样品应置于试管架上后装入自封袋中，防止运输过程中撞裂污染其他样品，注明采样场点、采样时间、样品名称、数量、编号等。外包装上标注放置的方向，并贴封条，封条上应有采样人签章、贴封日期。7 样品的保存与运输 样品的保存 7.1.1 样品采集后无法在 12 h 内送达兽医实验室的，应根据不同的检测要求，分类保存在冰箱或低温冰柜中。7.1.2 供病毒分离的样品应在 0 以下低温保存，做核酸检测的样品可-20 及以下冷冻保存。7.1.3 送达

12、实验室，血清、口鼻拭子样品应在-20 以下冷冻保存；全血在 4 低温保存；皮肤结节和痂皮、组织、淋巴结等样品应-80 冷冻保存。样品的运输 7.2.1 样品采集后，应以最快最直接的途径送至实验室。7.2.2 对于采集后能在 24 h 内送达实验室的样品，可放在 4 的容器中冷藏运输；对于超过 24 h 内送达实验室的样品，在不影响监测结果的前提下在冷冻状态运送。7.2.3 样品运输箱应完整无损，密封防止漏液，必要时经清洁、灭菌后使用。运输箱内需加填防震材料避免样品晃动。样品运输应符合生物安全要求。8 采样记录 应清晰标识每份样品的编号，同时在采样单上填写采样相关信息。应记录养殖场（户）的地址和

13、经纬度，及养殖场（户）姓名、电话等信息。应记录养殖场（户）饲养动物的品种及数量，存栏数、死亡数、出现临床症状数。应记录采样牛品种、年龄、性别及耳标号。应记录精神状况、临床症状、产奶记录、死亡时间等信息。应详细记录免疫和用药情况，其中包括疫苗生产厂家、批号、注射方式、注射剂量、保存方式、免疫程序、末次免疫时间和用药名称、剂量、时间等信息。应记录采样时间、采样人姓名、电话等信息。将填写好的采样单装在透明自封袋中，一份随样品送实验室，一份给被采样单位，另一份留存备案。9 废弃物处置 在采样过程中产生的废弃物，包括采血器针头（装入采血器针头盖中）、手套、口罩、防护服等用品，需装入双层医疗废弃物专用垃圾

14、袋中，封口并对外表喷洒消毒后，按照医疗废物管理条例进行无害化处理。DB15/T 41952025 5 在样品处理过程中产生的采血器、移液器吸头等废弃物，需装入医疗废弃物专用垃圾袋中，经 121 高压 30 min 后，按照医疗废物管理条例进行处理。采集病料及组织使用过的器械，消毒清洗后，需经 121 高压蒸汽或煮沸 30 min 灭菌处理。DB15/T 41952025 6 A A 附录A （资料性）试剂的配置 A.1 0.01mol/L pH7.4 PBS 缓冲液 A.1.1 氯化钠（NaCl）8 g。A.1.2 氯化钾（KCl）200 mg。A.1.3 磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44

15、 g。A.1.4 磷酸二氢钾（KH2PO4）240 mg。A.1.5 称取上述各试剂依次加入到800 mL去离子水或超纯水的容量瓶中，充分溶解并搅拌均匀后，用1 mol的HCI或NaOH调pH到7.4，再加入去离子水或超纯水定容到1 L，分装高压灭菌后备用。A.2 10%甘油 PBS 保存液 hanks平衡盐10倍浓缩液：a)氯化钠（NaCl）80 g；b)氯化钾（KCl）4.0 mg；c)硫酸镁（MgS047H2O）1.0 g；d)氯化镁（MgCL2）1.0 g；e)氯化钙（CaCL2）1.4 g；f)葡萄糖 10 g。称取上述各试剂依次放入到 800 mL 去离子水或超纯水的容量瓶中，充分溶解并搅拌均匀后，再加入去离子水定容到 1 L，分装高压灭菌后备用。