DB15 T 4256-2026 牛疱疹病毒4型感染诊断技术.pdf

1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 42562026 牛疱疹病毒 4 型感染诊断技术 Diagnostic techniques for bovine herpesvirus 4 infection 2026-01-15 发布2026-02-15 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 42562026 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古

2、自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：金宇保灵生物药品有限公司、内蒙古金迈诗生物科技有限公司、内蒙古农业大学、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、土默特左旗动物疫病防控中心、通辽市动物疫病预防控制中心、内蒙古自治区质量和标准化研究院。本文件主要起草人：刘玉梅、刘东霞、赵利平、张彦婷、陈学飞、关平原、李劼、徐晓静、赵丽霞、郭宇、刘慧、庄金山、刘利军、石明伟、张鸣华、杨晓婷、宋鑫。DB15/T 42562026 1 牛疱疹病毒 4 型感染诊断技术 1 范围 本文件规定了牛疱疹病毒4型感染临床诊断和实验室诊断技术方法、操作程序和判定标准，包含样品采集、保存和处理，病毒

3、分离与鉴定，实时荧光PCR以及病毒中和抗体检测技术。本文件适用于牛饲养场（户）和动物疫病检疫、诊疗单位对牛疱疹病毒4型感染的诊断、监测和流行病学调查等。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。牛疱疹病毒4型（牛伽玛疱疹病毒4型,BoHV-4

4、bovine gammaherpesvirus 4,BoHV-4 属于正疱疹病毒科(Orthoherpesviridae)、-疱疹病毒亚科（Gammaherpesvirinae）、细长病毒属（Rhadinovirus），是一种双链DNA病毒，病毒颗粒较大（直径150 nm200 nm），是有囊膜的二十面体粒子，基因组大小约144 kb。牛疱疹病毒4型感染 bovine herpesvirus type 4 infection 牛伽玛疱疹病毒4型（Bovine gammaherpesvirus 4,BoHV-4）侵入牛体的组织、器官，在其中生长、繁殖，并引起宿主出现病理反应的过程。4 缩略语

5、下列缩略语适用于本文件。BoHV-4：牛疱疹病毒4型（Bovine Herpesvirus type 4，BoHV4）CPE：致细胞病变效应（Cytopathic Effect）DMEM：DMEM培养基（DuLbeccos Modified Eagle Medium）DB15/T 42562026 2 MDBK 细胞：牛肾细胞（Bovine Kidney Cells）NBS：新生牛血清（Newborn Bovine Serum）PBS：磷酸盐缓冲溶液（Phosphate Buffer Saline）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）TCID50：半数细

6、胞培养物感染量（Median Tissue Culture Infective Dose）5 生物安全措施 样品采集的生物安全措施应符合GB/T 27401的规定,样品处理的生物安全措施应符合GB 19489的规定。6 临床诊断 流行病学 6.1.1 易感动物 通常主要感染牛，也可感染绵羊、山羊、豚鼠等，导致已感染动物出现繁殖障碍。6.1.2 传染源 病畜和带毒畜为主要传染源。6.1.3 传播途径 本病通过直接接触传播，也可通过间接接触传播，接触病畜和带毒畜的口鼻分泌物、生殖道分泌物均可感染本病，人工受精、胚胎移植也是其传播的潜在途径。6.1.4 流行特点 一年四季均可发生感染，无明显的季节性

7、与气候或温度变化无显著关联。临床症状 大多数呈隐性感染，发病牛主要临床症状表现为产后子宫炎、流产，翻开外阴肉眼可见点状白色水泡疹。病理变化 子宫肿大，子宫内膜充血、水肿，子宫壁增厚，子宫腔内可见大量浑浊、脓性渗出物。流产的胎儿可能自溶，或可见肝脏坏死等病变。结果判定 当牛出现上述症状和病理变化时，可判定为牛疱疹病毒4型感染的疑似病例。7 实验室诊断 病毒分离鉴定 DB15/T 42562026 3 7.1.1 主要试剂耗材 7.1.1.1 MDBK 细胞系。7.1.1.2 无菌棉拭子。7.1.1.3 NBS。7.1.1.4 DMEM 培养基。7.1.1.5 青霉素（100 U/mL）。7.1

8、1.6 链霉素（100 g/mL）。7.1.1.7 细胞培养板。7.1.1.8 2%磷钨酸。7.1.2 主要仪器 7.1.2.1 电子天平。7.1.2.2 研磨仪。7.1.2.3 台式冷冻离心机。7.1.2.4 生物安全柜。7.1.2.5 CO2培养箱。7.1.2.6 倒置显微镜。7.1.2.7 冰箱。7.1.2.8 微量可调移液器（20 L200 L、100 L1000 L、1000 L5000 L）。7.1.2.9 电子显微镜。7.1.2.10 超速冷冻离心机。7.1.3 样品采集与保存 7.1.3.1 采集与保存原则 按照NY/T 541执行。7.1.3.2 拭子 用无菌棉拭子反复刮擦

9、眼结膜、呼吸道粘膜、阴道粘膜、阴茎或包皮黏膜510次，蘸取分泌物后将棉拭子浸入2 mLPBS（配制方法按照附录A中的A.1执行）中，4 冷藏运输，24 h内送至实验室；对于不能在24 h内送达实验室样品，应以冷冻状态运送。取样进行检验时，振荡、挤干拭子，浸泡液采用4,000 g离心1 min，取上清液-20 保存备用。7.1.3.3 精液 取解冻或新鲜精液样品1 mL1.5 mL于微量离心管中，振荡混匀，采用5,000 g离心30 s，取上清液-20 保存备用。7.1.3.4 组织样品 无菌采集流产物或流产胎儿组织脏器1 g以上剪碎，加入2 mLPBS（配制方法按照附录A中的A.1执行），于研

10、钵或组织匀浆器中研磨制成悬液，5,000 g离心20 min，取上清液-20 保存备用。7.1.3.5 血清 DB15/T 42562026 4 用采样器采集待检活牛静脉血2 mL5 mL，4 保存，24 h内送至实验室。待凝固后，2,000 g离心5 min，取上清液-20 保存备用。7.1.4 病毒分离 取临床样品的处理组织液，经0.22 m针头滤器无菌过滤后，按照10%的比例接种到长满单层的MDBK细胞，按千分之一比例添加10万单位青链霉素混合液（配制方法按照附录A中A.2执行），置于37，含5%CO2的培养箱中吸附1 h 2 h 后，弃去处理组织液，根据培养容器重新加入适量病毒维持液（

11、配制方法按照附录A中A.3执行），同时设对照组，置于37，5%CO2培养箱，培养3 d5 d，逐日观察，记录细胞病变。如3 d5 d内不出现病变，按上述方法盲传35代，每代逐日观察细胞病变，当出现细胞变圆、大量脱落、贴壁细胞变长、聚集形成网状的典型病变（见附录B中B.1），则进行病毒特异性鉴定。7.1.5 病毒鉴定 7.1.5.1 取出现典型细胞病变培养物，反复冻融 3 次，以 3000 g 离心 10 min，取上清提取 DNA，采用实时荧光 PCR 进行核酸检测，进一步鉴定是否为 BoHV4。7.1.5.2 取采集组织样本制成 1:5 PBS 悬液或细胞培养物 3000 g 离心 30 m

12、in，取上清，15000 g 离心 30 min，取上清，以 40000 g 离心 5 h，弃上清，加 0.5 mL 蒸馏水悬浮，滴加铜网，2%磷钨酸负染30 min，室温下自然干燥后，电镜下观察病毒粒子形态。如电镜下观察发现，完整病毒颗粒(含包膜)直径约为 150 nm200 nm,呈球形，包膜表面可见糖蛋白形成的刺突结构（见附录 B 中 B.2）。可初步判定为牛疱疹病毒 4 型疑似病例。（选做）实时荧光 PCR 7.2.1 主要试剂耗材 7.2.1.1 微量可调移液器（1 L10 L、10 L100 L、20 L200 L、100 L1000 L）。7.2.1.2 无菌无酶离心管。7.2.

13、1.3 PCR 扩增管。7.2.1.4 病毒 DNA 提取试剂盒。7.2.1.5 商品化 PCR 预混液。7.2.1.6 阴性对照：DEPC 水。7.2.1.7 阳性对照：带目的片段的质粒 DNA，制备方法与基因序列见附录 C 中的 C.1 及 C.2。7.2.1.8 引物序列和探针见附录 C 中的 C.3，加 DEPC 水配制成 100 mol/L 的储存浓度和 10 mol/L工作浓度。7.2.2 主要仪器 7.2.2.1 实时荧光 PCR 仪 7.2.2.2 台式冷冻离心机。7.2.2.3 生物安全柜。7.2.2.4 旋涡混匀器。7.2.3 待检样品 处理后的样品或细胞培养物。DB15/

14、T 42562026 5 7.2.4 病毒 DNA 提取 使用病毒DNA提取试剂盒或用自动化核酸提取仪，提取已处理的待检样品（拭子、精液、细胞培养物、组织、血清等）中的DNA。7.2.5 实时荧光 PCR 7.2.5.1 反应体系 取BoHV-4上游引物（BoHV-4-F）、BoHV-4下游引物（BoHV-4-R）和BoHV-4探针（BoHV-4-P）参照附录C中的C.4进行引物、探针序列合成并用无菌的DEPC处理水配制成10 mol/L。同时设阴性对照和阳性对照。反应体系25L：2 Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）12.5 L，BoHV-4上游引物0.5 L，BoHV-

15、4下游引物0.5 L，BoHV-4探针1 L，RNase-Free ddH2O 8.5 L。将配制好的反应体系充分混匀，分装于0.2 mLPCR扩增管中，吸取待检样品、阴性对照、阳性对照的DNA溶液各2 L，加入到对应的PCR扩增管中，盖好管盖瞬时离心后，放入PCR仪中进行PCR反应。7.2.5.2 反应条件 每次PCR均应设阳性对照与阴性对照，参数：95 预变性2 min；95 变性15 s、56 退火/延伸30 s（收集信号），45个循环。7.2.6 样品结果判定 7.2.6.1 试验成立条件 7.2.6.1.1 阴性对照无 Ct 值或 Ct 值40 且未出现特异性扩增曲线。7.2.6.1

16、2 阳性对照 Ct 值30，并出现特异性扩增曲线，判为试验成立。否则，本次试验无效。7.2.6.2 样品结果判定 7.2.6.2.1 阴性 若待测样品Ct值40或无Ct值，则结果判定为BoHV-4核酸阴性。7.2.6.2.2 阳性 若待测样品出现特异性的扩增曲线，且Ct值35，则结果判定为BoHV-4核酸阳性。7.2.6.2.3 可疑 若待测样品35Ct值40，出现特异性的扩增曲线，则结果判定为BoHV-4核酸可疑，即该样品需要进行复检。如复检结果为阳性或可疑，则判定为BoHV-4核酸阳性，否则判定为阴性。病毒中和抗体测定 7.3.1 毒株 BoHV-4毒株，毒价106TCID50/mL。7

17、3.2 主要试剂耗材 7.3.2.1 离心管。7.3.2.2 新生牛血清。DB15/T 42562026 6 7.3.2.3 DMEM 培养基。7.3.2.4 青霉素（100 U/mL）。7.3.2.5 链霉素（100 g/mL）。7.3.2.6 96 孔细胞培养板。7.3.2.7 MDBK 细胞系。7.3.2.8 阴性对照血清、阳性对照血清。7.3.3 主要仪器 7.3.3.1 生物安全柜。7.3.3.2 CO2培养箱。7.3.3.3 倒置显微镜。7.3.3.4 冰箱。7.3.3.5 移液器（20 L200 L、100 L1000 L、1000 L5000 L）。7.3.4 待检样品 按照

18、7.1.3.5采集分离血清。7.3.5 操作步骤 7.3.5.1 血清灭活 将待检血清、阳性血清和阴性血清在56 水浴灭活30 min，取出备用。7.3.5.2 中和病毒工作液制备 用病毒维持液（配制方法按照附录A中的A.3执行）将中和用病毒稀释成200 TCID50/0.1 mL。7.3.5.3 血清稀释 将待检血清及阴性、阳性对照血清用含2%新生牛血清的DMEM培养基（按千分之一添加10万单位青链霉素混合液，配制方法按照附录A中的A.2执行），使用浓度为：青霉素100 U/mL、链霉素100 g/mL）从12开始作2倍系列稀释至164（或根据实际情况适当增加稀释度），将各稀释度待检血清以及

19、阳性和阴性血清分别加入96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，每孔50 L。7.3.5.4 中和 向各待检血清、阴性血清及阳性血清中加入200 TCID50/0.1 mL的中和病毒工作液50 L/孔，振摇混匀后，置37 中和1 h，期间振摇23次。7.3.5.5 其他对照设立 7.3.5.5.1 正常细胞对照 向正常细胞对照的4个孔中分别加入含2%新生牛血清的DMEM培养液100 L/孔。7.3.5.5.2 病毒回归对照 将病毒含量为200 TCID50/0.1 mL的病毒液作10、100、1000倍稀释，每个稀释度4孔，每孔50 L，并补加含2%新生牛血清的DMEM培养液50 L/孔（不作稀释

20、即为100 TCID50/0.1 mL、作10倍稀释即为10 TCID50/0.1 mL、作100倍稀释即为1 TCID50/0.1 mL、作1000倍稀释即为0.1 TCID50/0.1 mL）。DB15/T 42562026 7 7.3.5.5.3 病毒含量测定 将中和用病毒做10倍系列稀释，取10-410-7稀释度，每个稀释度各4孔，每孔100 L。7.3.5.6 加细胞悬液 向所有孔中加入浓度约为1020万个细胞/mL的含8%10%新生牛血清的MDBK细胞悬液100 L/孔，置37、5%CO2培养箱培养3 d5 d，每日用倒置显微镜观察细胞病变。7.3.6 结果判定 7.3.6.1 试

21、验成立条件 每日显微镜下观察细胞病变，培养3 d5 d后进行结果判定。阳性对照血清滴度不应比其已知效价差1个滴度以上；阴性血清中和抗体效价应不高于1:4；正常细胞对照不产生CPE；病毒回归对照中0.1 TCID50/0.1 mL孔不产生CPE，100 TCID50/0.1 mL孔全部产生CPE；病毒含量测定的TCID50值不应比其已知TCID50值差0.5个滴度以上。7.3.6.2 判定标准 统计待检血清的细胞病变孔数，按Reed-Muench法计算血清中和抗体效价：a)病毒中和抗体滴度1:4 判为阴性；b)1:4病毒中和抗体滴度1:8 判为可疑；c)病毒中和抗体滴度1:8 判为阳性。8 综合

22、判定 经 7.1 或 7.2 检测结果为阳性，可判定为牛疱疹病毒 4 型感染病例。经 7.3 检测结果为阳性，判定为牛疱疹病毒 4 型曾经感染或正在感染。DB15/T 42562026 8 A A 附录A （规范性）试剂的配制 A.1 0.04 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（PBS 液）配制 称量NaCl 8.5 g、Na2HPO4.12H2O 14.3 g、KH2PO4 0.5 g，蒸馏水定容至1000 mL后，121 高压灭菌15 min备用。A.2 10 万单位青霉素和链霉素混合液配制 将10支青霉素（160万单位）和16支硫酸链霉素（100万单位/1 g）加入纯化水使其全部溶解，定容到1

23、60 mL,用0.22 m滤器过滤后放-20 度保存备用。使用时按千分之一比例加入培养体系，确保硫酸链霉素终浓度为100 ug（100单位）/mL，青霉素终浓度为100单位/mL。A.3 病毒维持液配制 取 980 mL DMEM 培养基与 20 mL NBS 混合均匀，4 密封保存，建议现配现用。DB15/T 42562026 9 B B 附录B （资料性）病毒分离鉴定 B.1 BoHV4 细胞病变示意图 BoHV4细胞病变示意图见图B.1。a)正常MDBK细胞对照图 b)BoHV4感染MDBK细胞病变图 图B.1 BoHV4 细胞病变示意图 B.2 牛疱疹病毒 4 型电镜图（选做）牛疱疹病

24、毒 4 型电镜图见图 B.2。BoHV-4 具有疱疹病毒共有的一般形态特征，有囊膜，核衣壳呈立体对称的正 20 面体，直径约 100 nm，而整个病毒粒子的直径约 150 nm。该病毒为有囊膜病毒，BoHV-4 电镜图见图 B.2。图B.2 牛疱疹病毒 4 型电镜图 ABDB15/T 42562026 10 C C 附录C （资料性）实时荧光 PCR C.1 实时荧光 PCR 检测阳性对照的制备 将牛疱疹病毒4型gB基因160 bp目的片段连接pMD19-T载体，再转化到JM109感受态细胞中，制备成重组大肠杆菌菌株，克隆培养后提取重组质粒。取适量质粒，使用超微量核酸蛋白仪测定浓度，按公式“c

25、opies/L=（6.021023 copies/mol浓度ng/L）/（DNA碱基数6.601011 ng/mol）”计算质粒的拷贝数（copies），用TE缓冲液连续梯度稀释至1104 copies/L，作为阳性对照，检验后定量分装。C.2 牛疱疹病毒 4 型 gB 部分基因实时荧光 PCR 产物可扩增 160 bp 目的片段核苷酸序列 TCTTATTCTTCACTCTAATTAAGGTATGCAGTTTCAACCAGACCACTACACACTCAACCACAACCTCACCAAGTATTTCATCAACCACCTCTTCCACAACAACATCAACAAGCCAGCCATCAAACACAACCTCAACAAATAGTTCATTAGCTGCCTCTCC C.3 引物、探针信息 实时荧光 PCR 引物、探针序列见表 C.1。表C.1 实时荧光 PCR 引物、探针序列 名称 序列（5-3）BoHV4-F TCTTATTCTTCRCTCTAATTAAGGTAT BoHV4-R GGAGAGGCAGCTAATGAACTA BoHV4-P FAM-ACCTCTTCCACAACAACATCAACAAGCMA-TAMRA C.4 引物、探针溶解 上下游引物和探针用无菌的 DEPC 处理水配制成 10 mol/L。