DB32 T 5377—2026 人源心脏类器官在化学品毒性测试中的应用技术规范.pdf

1、7,江苏省市场监督管理局 发 布中 国 标 准 出 版 社 出 版人源心脏类器官在化学品毒性测试中的应用技术规范Technical specifications for the use of human heart organoid in chemical toxicity testingCCS C 10DB32/T 53772026ICS 11.10020260403 发布20260503 实施DB32/T 53772026前言 1 范围 12 规范性引用文件 13 术语和定义 14 原理 25 要求 26 试验步骤 27 结果评价 38 试验报告和结果评定 3附录 A（资料性）人源心脏类

2、器官毒性测试的培养板布局与处理 4附录 B（资料性）人源心脏类器官形态检测 6附录 C（资料性）人源心脏类器官存活率检测 7附录 D（资料性）人源心脏类器官收缩功能检测 8参考文献 9目 次DB32/T 53772026前言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省卫生健康委员会提出并组织实施。本文件由江苏省卫生健康标准化技术委员会归口。本文件起草单位：南京医科大学、同济大学附属东方医院、苏州疾病预防控制中心。本文件主要起草人：顾爱华、徐进、杨杨、刘倩

3、周勇、吉贵祥、李仲、蒋兆彦、邵文涛、李庆国、胡佳、金经、郭文慧、顾杰。DB32/T 53772026人源心脏类器官在化学品毒性测试中的应用技术规范1范围本文件给出了人源心脏类器官在化学品毒性测试中的原理和技术要求。本文件适用于人源心脏类器官在化学品毒性测试中的技术规范。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 25915.5 洁净室及相关受控环境 第 5 部分：运行3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1人源心脏类器官h

4、uman heart organoid由人多能干细胞体外分化组装获得的，包含心肌细胞和多种心脏非心肌细胞在内的腔室化结构。注：其生理结构和功能与人类心脏高度相似，具有收缩和舒张功能。3.2毒性测试toxicity testing通过实验方法评估化学品等对生物体潜在有害作用的过程。3.3阳性对照positive control按照本文件试验可产生人源心脏类器官毒性反应的化学品。注：阳性对照的目的是显示适用试验系统的反应。来源：GB/T 16886.52017，3.2，有修改3.4空白blank含人源心脏类器官，不含试验化学品和试验化学品溶剂的参照组，试验期间置于与试验组相同的培养板中，并经受与试

5、验组相同的条件。来源：GB/T 16886.52017，3.3，有修改3.5阴性对照negative control按照本文件试验时不产生人源心脏类器官毒性反应的化学品。注：阴性对照的目的是显示细胞的背景反应。来源：GB/T 16886.52017，3.4，有修改1DB32/T 537720263.6溶剂对照solvent control含人源心脏类器官和试验化学品溶剂，不含试验化学品，试验期间置于与试验组相同的培养板中，并经受与试验组相同的条件。注：溶剂对照的目的是检测试验化学品溶剂可能产生的误差而设置的参照组，以确保试验结果的准确性和可靠性。4原理检测化学品处理下，合格的人源心脏类器官形态

6、存活率、收缩功能的变化，以评价化学品是否存在心脏毒性。5要求5.1环境保障应按 GB/T 25915.5 的要求建立运行体系，包括风险控制、人员培训、洁净服、人员行为、室内物流、日常清洁等方面的洁净室运行规范。5.2人源心脏类器官质量要求5.2.1形态状态良好，外观无明显差别，呈三维立体囊球状，内含空腔，直径在 1 mm2 mm 范围内。5.2.2细胞组成心肌组织内形成由心内膜衬里的腔室结构，同时包含散在分布的心脏成纤维细胞及内皮细胞，外部覆盖完整的心外膜组织。5.2.3功能指标呈现强劲而规律的自主搏动。5.2.4微生物指标微生物指标宜按照 GB/T 40365 进行检测，无微生物污染。6试

7、验步骤6.1分组及布局将合格的人源心脏类器官接种于培养板中，每孔接种 1 个。培养板布局和处理宜参考附录 A。根据待测化学品的实际使用浓度或人体内暴露浓度确定其最佳测试浓度范围，并在此范围内设置至少 5 个浓度梯度。同时设置溶剂对照、阳性对照、阴性对照和空白对照组。每组至少采用 3 个平行试验样本数。根据待测化学品毒性特点，经过至少 24 h 培养后，按 6.26.4 确定毒性反应。6.2形态检测人源心脏类器官形态检测宜参考附录 B 的规定。2DB32/T 537720266.3存活率检测人源心脏类器官存活率检测宜参考附录 C 的规定。6.4收缩功能检测人源心脏类器官收缩功能检测宜参考附录 D

8、 的规定。7结果评价7.1与空白组相比，检测数据下降大于 30%被认为有人源心脏类器官毒性反应。7.2各组平行样的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效，这种情况下应重复试验。7.3阳性对照、空白及阴性对照组在试验系统中如无预期反应，应重复整个试验。8试验报告和结果评定8.1试验报告试验报告应至少包括下列各项内容：a）试验机构名称和地址；b）试验操作者姓名；c）试验开始和结束日期；d）化学品、阳性对照和阴性对照的信息，包括厂家、批号、性状、配制方法、浓度等；e）试验方法、原理和具体步骤；f）试验结果；g）试验人签字或单位签章；h）结果评定所需的任何其他相关数据。8.2结果评定应由有能力根据

9、试验数据做出判定的人员进行结果的总体评定。任何人源心脏类器官毒性反应可能都是重要的。但是，这主要预示该化学品潜在的心脏毒性。3DB32/T 53772026附录A（资料性）人源心脏类器官毒性测试的培养板布局与处理A.1概述本试验方案适用于 96 孔细胞培养板。其他孔数的多孔板可参考本方案。A.2试剂材料A.2.1磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS），无菌。A.2.2人源心脏类器官培养基，无菌。A.2.3具有疏水表面、透光良好的非再造聚苯乙烯细胞培养板，无菌。A.2.4阳性对照化学品：包括但不限于阿霉素。A.2.5阴性对照化学品：包括但不限于二甲基亚砜。A.

10、2.6待测化学品。A.3仪器设备A.3.1超净工作台。A.3.2细胞培养箱：温度 37 0.2，CO浓度 5%0.1%，相对饱和湿度95%。A.3.3微量移液器。A.4试验步骤A.4.1培养板宜使用 96 孔板，宜参考以下布局（见图 A.1）。a）96 孔板边缘孔不接种人源心脏类器官，每孔加入 200 L PBS。b）将合格的人源心脏类器官接种于相应孔中，每孔接种 1 个类器官并加入 200 L 人源心脏类器官培养基。c）空白对照实验布局：96 孔板中 B 行第 79 列区域。设置 3 个平行样本。d）阴性对照实验布局：96 孔板中 C 行（溶剂对照）及 D 行的第 79 列区域。每组设置 3

11、 个平行试验样本。e）阳性对照实验布局：96 孔板中 F 行（溶剂对照）及 G 行的第 79 列区域。每组设置 3 个平行试验样本。f）待测化学品实验布局：96 孔板中 B 行（溶剂对照）及 C 至 G 行（5 个浓度梯度）的第 24 列区域。各浓度设置 3 个平行试验样本。注：涉及的阴性对照化学品包括但不限于：二甲基亚砜（体积分数不超过 0.02%）；涉及的阳性对照化学品包括但不限于：阿霉素（建议设定浓度为 5 mol/L）。A.4.2人源心脏类器官化学品处理：a）移除孔板中的培养基；b）根据图 A.1 布局，每孔加入 200 L 含特定浓度化学品的人源心脏类器官培养基；c）将孔板置于细胞培

12、养箱中培养。4DB32/T 53772026 3#&/+&3K&3#&K&3K&3K&3#&3#&3 3 3 3 31#4/+&3K&3#&K&3K&3#&K&3图 A.1 人源心脏类器官培养板布局5DB32/T 53772026附录B（资料性）人源心脏类器官形态检测B.1仪器设备倒置相差显微镜：具有 4 倍、10 倍、20 倍物镜。B.2试验步骤使用倒置相差显微镜拍摄人源心脏类器官图像，确保图像清晰且类器官边界与背景对比度高。B.3结果分析使用软件对所获取的图像进行综合分析，以测量人源心脏类器官的周长和/或面积。具体操作请参考软件使用说明。6DB32/T 53772026附录C（资料性）人源

13、心脏类器官存活率检测C.1试剂材料C.1.1钙黄绿素（CalceinAM）/碘化丙啶（PI）双荧光染色试剂。C.1.2磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution，PBS），无菌。C.2仪器设备C.2.1倒置荧光显微镜：显微镜激发波长范围为 355 nm675 nm，发射波长范围为 430 nm760 nm。C.2.2微量移液器。C.3试验步骤C.3.1配制 CalceinAM/PI 工作液，使其浓度分别为 2 mol/L 和 4.5 mol/L。C.3.2弃去每孔原有人源心脏类器官培养基，PBS 冲洗三遍。C.3.3每孔加入 100 L CalceinAM/PI 工作液，

14、孵育 15 min。C.3.4荧光显微镜下观察染色结果：CalceinAM 标记活细胞，呈绿色荧光，激发/发射波长为 494/517 nm；PI 标记死细胞，呈红色荧光，激发/发射波长为 535/617 nm。C.3.5采集 CalceinAM 绿色荧光和 PI 红色荧光的整体信号值，根据荧光强度反映活细胞和死细胞比例。7DB32/T 53772026附录D（资料性）人源心脏类器官收缩功能检测D.1仪器设备倒置相差显微镜：具有 4 倍、10 倍、20 倍物镜。D.2试验步骤倒置相差显微镜连续拍摄人源心脏类器官，获取 30 s 视频，要求视频帧率不低于 50 fps，分辨率不低于 640480，并确保光源稳定。D.3结果分析使用软件对所获取的视频进行综合分析，以获得人源心脏类器官的收缩幅度、持续时间、到峰时间等指标。具体操作请参考软件使用说明。8DB32/T 53772026参 考 文 献1 GB/T 16886.5 医疗器械生物学评价 第 5 部分：体外细胞毒性试验2 GB/T 40365 细胞无菌检测通则9