GB T 15399-1994 饲料中含硫氨基酸测定方法--离子交换色谱法.pdf

1、GBT 1539994 1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中含硫氨基酸的测定方法。 本标准适用于单一饲料、配合（混合）饲料及浓缩饲料。 2 引用标准 GBT 6432 饲料粗蛋白质测定方法 GBT 6439 饲料水溶氯化物测定方法。 3 原理 饲料中的含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）用过甲酸氧化并经盐酸水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，此二产物可用离子交换色谱法分离测定。 4 试剂 除特别注明者外，所有试剂均为分析纯，水为去离子水，电导率小于1MS。 4.1 过甲酸溶液 4.1.1 常规过甲酸溶液：将30过氧化氢（GB 6684）与88甲酸（HG 31296） 按19（ V V）混合，

2、于室温下放置1h，置冰水浴中冷却30min，临用前配制。 4.1.2 浓缩料用过甲酸溶液：将常规过甲酸溶液中按3mgmL加入硝酸银（GB 670）即可。此溶液适用于氯化钠含量小于3的浓缩料。 当浓缩料中氯化钠含量大于3 时 ，氧化剂中硝酸银浓度可用下式计算： 4.2 氧化终止剂 4.2.1 48氢溴酸（GB 621） 4.2.2 偏重亚硫酸钠溶液：33.6g偏重亚硫酸钠（HG 3 909） 加水定容至100mL。 4.3 酸解剂 4.3.1 6.0molL盐酸溶液：将优级纯盐酸（GB 622）与水按11（ V V）混合。 4.3.2 6.8molL盐酸溶液：将优级纯盐酸（GB 622）1133

3、mL加水稀释重2000mL。 CR1.454 m CN（1）式中： CR过甲酸中硝酸银的浓度，mgmL；CN样品中氯化钠含量，mgmL；m 样品质量，mg。页码，1/3GB/T 15399942006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB153990K.htm4.4 7.5molL氢氧化钠溶液：取优级纯氢氧化钠（GB 629）30g，加水溶解并定容至100mL。4.5 稀释上机用柠檬酸钠缓冲液，pH2.2，0.2molL Na：称取柠檬酸三钠（HG 31298）19.6g，用水溶解后加入优级纯盐酸16.5mL，硫二甘醇5.0mL，苯酚（HG 31165）1g，最

4、后加水定容至1000mL，用G4垂熔玻璃砂芯漏斗过滤。 4.6 不同pH及离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液：按仪器说明书配制。 4.7 茚三酮溶液：取茚三酮适量，按仪器说明书配制。 4.8 磺基丙氨酸-蛋氨酸砚标准贮备液，2.50 molmL：准确称取磺基丙氨酸105.7mg和蛋氨酸砜113.3mg，加水溶解并定容至250mL。 4.9 氨基酸混合标准贮备液：含有L-天门冬氨酸、L-苏氨酸等17种常规蛋白质水解分析用L-氨基酸，各组份浓度为2.50 molmL。 4.10 混合氨基酸标准工作液：吸取磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准贮备液（4. 7）和氨基酸混合标准贮备液（4.8）各1.00mL，置于50

5、mL容量瓶中，加稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.4）定容，混匀。有关各组份浓度为50nmolmL。 5 仪器、设备 5.1 实验室用样品粉碎机； 5.2 样品筛：孔径0.45mm（40目）； 5.3 分析天平：感量0.0001g； 5.4 喷灯； 5.5 旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至65间调温，控温精度1，真空度可低至3.3103Pa（25mmHg柱）。5.6 恒温箱或水解炉； 5.7 氨基酸自动分析仪：要求蛋氨酸砚的分辨率大于90。 6 样品 取具代表性的饲料样品，用四分法缩减分取25g左右，粉碎并过0.45mm孔径（40目）筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。 7 分析步骤 7.1 氧化和水解

6、：称取含蛋白质7.525mg的试样双份（精确至0.0001g，样品量不超过75mg），置于旋转蒸发器20mL浓缩瓶或浓缩管中，于冰水浴中冷却30min后加入已经冷却的过甲酸溶液（4.2）2mL，加液时需将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同冰浴一道置于0冰箱中，反应16h。 以下步骤依使用不同的氧化终止剂而不同： 若以氢溴酸为终止剂，于各管中加入氢溴酸（4.1）0.3mL，振摇，放回冰浴，静置页码，2/3GB/T 15399942006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB153990K.htm30min，然后移到旋转蒸发器或浓缩器（5.5）上，在60、低于

7、3103Pa（25mmHg 柱）下浓缩至干。用盐酸溶液（4.3.1）约15mL将残渣定量转移到20mL安瓿中，封口，置恒温箱中、1101下水解2224h。也可用6.0molL盐酸溶液约25mL将残渣转移到50mL消煮管中，于水解炉中、1103下回流水解2224h。 取出安瓿或水解管，冷却，用水将内容物定量地转移至50mL容量瓶中，定容。充分混匀，过滤，取12mL滤液，置旋转蒸发器或浓缩器中，在低于50的条件下，减压蒸发至干。加少许水重复蒸干23次。准确加入一定体积（25mL）的稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.5）振摇，充分溶解后离心，取上清液供仪器测定用。 若以偏重亚硫酸钠为终止剂，则于样品氧化

8、液中加入偏重亚硫酸钠溶液（4.2.2）0.5mL，充分摇匀后，直接加入盐酸溶液（4.3.2）17.5mL，置1103水解2224h。 取出水解管，冷却，用水将内容物转移到50mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液（4.4）中和至pH约2.2，并用稀释上机用缓冲液（4.5）定容，离心，取上清液供仪器测定用。 如氨基酸分析受上机样品液中Na浓度影响，色谱峰出峰时间漂移过大，则需先将水解液定容过滤，而后取25mL滤液，于50下，减压蒸发至约0.5mL（切勿蒸干），用稀释上机用缓冲液（4.5）将其转移至10mL容量瓶中，加氢氧化钠溶液（4.4）调至pH2.2，并用稀释上机用缓冲液（4.5）定容。混匀，离心，取上

9、清液供仪器测定用。 浓缩料测定首先按GB 6439测定其NaCl含量。样品处理步骤同上，只是氧化剂使用4.1.2。 7.2 测定：用混合氨基酸标准工作液（4.9），按仪器说明书，调整仪器的操作 参数和（或）洗脱用柠檬酸缓冲液（4.5）的pH，使蛋氨酸砜分辨率达最佳状态（大于或等于90），注入制备好的样品和氨基酸标准工作液（4.9），进行分析测定。每5个样品（即10个单样）为一组，组间插入混合氨基酸标准工作液（4.9）进行校准。 8 分析结果的表述 分析结果表示为胱氨酸和蛋氨酸在样品中的质量百分率，计算公式如下： 以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数。 9 重复性 两个平行样品测定值的相对偏差，当胱（蛋）氨酸的含量小于0.50时，不大于5；大于0.50时，不大于4。 （2）式中： A每毫升上机样品液中胱（蛋）氨酸的含量，ng；m 样品质量，mg；D 样品稀释倍数。页码，3/3GB/T 15399942006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB153990K.htm