GB T 4789.9-2003 食品卫生微生物学检验 空肠弯曲菌检验.pdf

1、GB/T 4789.9-2003 60 前言本标准对GB/T4789. 9-1994(食品卫生微生物学检验空炀弯曲菌检验进行修订。本标准与GB/T4789. 9-1994相比主要修改如下:一一按GB/T1. 1-2000对标准文本的格式和文字进行修改。一一修改并规范原标准中的设备和材料气本标准自实施之日起.GB/T4789. 9-1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位s中国迸出口商品检验技术研究所、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人z孟洪德、冉陆、付拌、姚景会。本标准于1984年首次发布.1994年第-次修订，本次为第二次修订。1 范回食品

2、卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验本标准规定了空肠弯曲菌的检验方法。本标准适用于各类食品和食物中毒样品中空肠弯曲菌的检验。2 规范性引用文件GB/T 4789.9-2003 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目朔的引用文件，其最新版本适用于本标准.GB/T 4789. 28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 设备和材料3. 1 冰箱，OC4 C. 3.2 恒温培养箱，42C土1C、36 c :1: 1

3、 c、25C士1C。3.3 恒温水浴锅，3 7 c :1: 1 c。3.4 显微镜，10X100X。3.5 相差显微镜。3.6 离心机，3000r/mn。3. 7 均质器或灭菌乳钵。3.8 厌氧罐2带有双相压力表。3.9 液氮罐。3. 10 气袋。3. 11 灭菌厚壁毛细管。3. 12 灭菌培养皿=直径90mm。3. 13 灭茵锥形瓶，500mL. 3. 14 灭菌刀、剪子、慑子等。4 培养基和试剂4. 1 蛋白陈水2按GB/T4789. 28-2003中3.13规定.4.2 Cary-Blar氏运送培养基z按GB/T4789.28-2003中4.52规定。4.3 改良Camp-BAP培养基2

4、按GB/T4789. 28-2003中4.53规定.4.4 Skrrow氏培养基:按GB/T4789. 28-2003中4.54规定.4.5 氧化酶试JfiJ，按GB/T4789. 28-2003中3.18规定。4.6 3%过氧化氢液=按GB/T4789. 28-2003中3.20规定。4.7 1%甘氨酸培养基z按GB/T4789.28-2003中4.56规定。4.8 30用荼皖酸圆形滤纸片。4.9 三糖铁培养基2按GB/T4789. 28-2003中4.26规定。4. 10 革兰氏染色液z按GB/T4789. 28-2003中2.2规定。61 GB/T 4789.9-2003 TTC琼脂g按

5、GBjT4789. 28-2003中4.55规定。马尿酸纳培养基按GBjT4789. 28-2003中3.9规定。三氯化铁2按GBjT4789. 28-2003中3.9规定。快速硫化氨(H，S)试验琼脂z按GBjT4789. 28-2003中4.50规定。DNA酶甲基绿琼脂按GBjT4789. 28-2003中4.51规定。4. 11 4. 12 4. 13 4. 14 4. 15 检验程序5 空肠弯曲菌检验程序见图1，样检卢草丛-一民提色土改良Cam!如BAP布民杆菌培养基平动力试验4(氧化酶试验-r J一盯试验襄睫醺试验寸-王E唔7刷徽嗣产寸,L, :c -r (过氧化氢酶试验产直接相量镜

6、检,L r上硝酸盐还匾试验一生长温度试验 川氧化铀试验L寸一硫化氢试验寸-四川甘氨酸试验I卢1革才LU门团1操作步骤6 6. 1 样晶的采集及处理食物样品采集后应尽快进行检验。如果样品必须运送和保存，应使用Cary-Blair半固体培养基。弯曲菌的存活时间取决于温度，在25C情况下，其存活时间不到24h或更短，因此样品在原始分离前需GB/T 4789.9-2003 放冰箱或冷处保存。6.2 微需氧条件的制备最佳微需氧条件是氧气为5%、二氧化碳为10%、氮气为85%。6. 2. 1 带有双相压力计(可表示正负压的)厌氧罐2在装皿密封后，先抽去罐内空气至负压7.3X10Pa(550 mmHg)处，

7、输入上述三种混合气体使罐内压力恢复于零z再将罐内气体抽至负压7.3X10Pa(550 mmHg)同样输入上述气体至零，即可放置缸箱培养.6.2.2 气袋法z操作时只使用气体发生剂而不加催化剂.6.2.3 双平板法g取两块平板，一块平板接种已知的兼性厌氧菌如变形杆菌)，另一块平板接种样品，去掉皿盖，将含琼脂的两只皿相对合齐并用胶布粘封，放入密封不漏气的罐内(或袋内)进行培养。由于兼性厌氧菌生长的代谢作用，可使小环境中的氧气浓度下降和二氧化碳浓度上升。6.2.4 蜡烛缸法z将已接种细菌的平板置于容量2000mL的磨口标本缸或干燥器内。缸盖及缸口涂以凡士林，放入小段点燃蜡烛于缸内(勿靠近缸壁，以免烤

8、热缸壁而炸裂)，盖密缸盖。缸内燃烛约0, 5 min- 1 min，因氧减少自行熄灭，此时容器内约含二氧化碳5%10%。最后连同容器一并置于42C土1C温箱中培养。6.3 分离培养6. 3. 1 拭子或液体可直接在选择性培养基如改良Camp-BAP布氏杆菌培养基或使用Skirrow氏培养基平板上划线接种。于42C培养48h后，观察可疑菌落。6.3.2 第一型菌落不溶血，灰色、扁平、湿润、有光泽，看上去像水滴，有从接种线向外扩散的倾向;第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的单个菌落(直径为1mm2 mm)，边缘完整、发亮。6.4 初步鉴定将可疑菌落做氧化酶和过氧化氢酶试验，如为阳性，则涂片做革兰氏染

9、色。本菌为革兰氏阴性菌，大小为(0.3mO.4m)X(1.5m3m) ，呈S形、螺旋状或纺锤形。在固体培养基上培养时间过久或在不适条件下则常呈现球形菌。在暗视野或相差显微镜下观察，动力明显。根据菌落生长特征、菌体染色、动力、氧化酶和过氧化氢酶试验阳性者，可初步确定为弯曲菌.6.5 确定鉴定经初步鉴定后，仍需做下述试验(以下各项试验均需在5%氧气的微需氧环境中培养儿6. 5. 1 甘氨酸耐受性试验接种于甘氨酸培养基中，培养48h，如为阳性，在培养基表面有云雾状生长，则为弯曲菌空肠亚种。6.5.2 硫化氢生长试验2接种于TSI斜面上，并吊一根乙酸铅滤纸条于管口，培养物经48h72 h培养，空肠弯曲

10、菌一般在斜面上少量生长，其反应为碱性/碱性(K/K)，滤纸条变黑，但培养基底都不因硫化氢而变黑。6.5.3 对3.5%氯化纳的耐受性试验2接种于3.5%含盐肉汤培养基，经48h培养，空肠弯曲菌不生长。6.5.4 42C和25C生长试验z将培养物接种于两管布氏肉汤中，一管放于42C，一管放于25C培养48 h，42C生长而25C不生长者，则为空肠弯曲菌。6.5.5 马尿酸销水解试验g将培养物接种于马尿酸锅培养基，于42C培养48h，离心沉淀取出部分上清液。加入三氯化铁试剂，如出现恒久沉淀物则为阳性，空肠弯曲菌呈阳性反应。6.5.6 荼睫酸试验z将可疑空肠弯曲菌涂布接种于血平板上，然后贴上含30g

11、茶院酸的滤纸于平板上，空肠弯曲菌敏感而肠道弯曲菌不敏感。6.5.7 TTC(2，3，5-氯化三苯四氮瞠)试验2空肠弯曲菌在TTC培养基上呈阳性，而胎儿弯曲菌为阴性，阳性者为紫色菌苔并有光泽。6.5.8 硝酸盐还原试验z取培养物的浓菌悬液，在37C放置2h，加入试剂，观察颜色反应，空肠弯曲菌呈红色的阳性反应。63 GB/T 4789.9-2003 6.5.9 弯曲菌的生化鉴别见表1。表1弯曲菌属各个种的生化性状胎儿弯曲菌痰弯曲菌项目粪弯曲离胎儿亚种结肠亚种空肠亚种痰亚种牛亚种过氧化氢酶+ + 十+ 氧化酶+ + 十+ + 十1%甘氨酸试验十十十十+ + 硫化氢试验(纸条法)十十十+ + 3.5%

12、氯化锅耐受试验d d 25(;生长试验+ (-) d 42(;生长试验十+ + 十? 硝酸盐还原试验十+ 十+ ? d 荼睫酸试验十? d TTC试验+ 十马尿酸销水解十注2十90%和90%以上阳性，d有的阴性，有的阳性，(-)一般不生长，-90%和90%以上阴性，。未知.6.6 生物分型6. 6. 1 快速马尿酸锅水解试验:将细菌接种在1%马尿酸铀0.4mL.37C水浴2h.再加丙团与丁困溶液的3.5%苟三酣O.Z mL.徐徐加人避免相混，放置10min后观察结果。深紫色为阳性，淡紫色或无色为阴性。6.6.2 快速硫化氢(H，S)试验E取一环细菌悬浮于快速硫化氢半固体琼脂上二分之一段.37C

13、水浴Z h.观察结果，细菌团块周围变黑为阳性。6.6.3 DNA酶水解试验g细菌点种于DNA酶甲基绿琼脂平板上，微需氧环境培养3d5 d.菌苔周围出现无色透明环为阳性。生物分型结果见表2。表2空肠宵曲菌等的生物分型生物型试验空肠弯曲菌弯曲菌嗜热弯曲菌I E 皿N I 日I E 快速马尿酸铺试验+ 十十十快速硫化氢试验十+ + 十DNA酶水解+ + 十+ 6.7 血清分型空肠弯曲。因子分型应采用间接血凝法.H或K因子分型可用破片凝集法。6.8 菌种保存空肠弯曲菌菌种应接种在改良Camp-BAP斜面培养基上(棉塞不宜过紧).于42C43C微需氧中培养48h后，置4C冰箱微需氧内可保存10d14 d.需要时仍可转种一次，长期保存用冻干法。6.9 注意事项对空肠弯曲菌检验时，应严格执行元菌操作，防止自身感染。64