GB T 5009.82-2003 食品中维生素A和维生素E的测定.pdf

1、ICS 67.040 C 53 G 中华人民共和国国家标准GB/T 5009.82-2003 代替GB/T12388一1990食品中维生素A和维生素E的测定Determination of retinol and tocopherol in foods 2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生变发布中国国家标准化管理委员高GB/T 5009.82-2003 前言本标准第法对应于AOAC.992. 06( Il )(婴幼儿配方食品中维生素A的测定高效液相色谱法以CAC引用1994年版)。本标准第二法对应于AOAC.974. 29(凹)(特殊食品中维生素A的测定一一比色法

2、(CAC引用1994年版)。本标准与AOAC.992. 06( Il)和AOAC.974. 29(W)的一致性程度为非等效。本标准代替GB/T12388-1990(食物中维生素A和维生素E的测定方法儿本标准与GB/T12388-1990相比主要修改如下:一一修改了标准的中文名称，标准中文名称改为食品中维生素A和维生素E的测定h一一按GB/T20001. 4-2001 (标准编写规则第4部分2化学分析方法对原标准的结构进行了修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位z中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所。本标准主要起草人王光亚、李晶、王国栋。原标准子1990年首次发布，本次为

3、第一次修订。592 食品中维生素A和维生素E的测定1 范围本标准规定了食品中维生素A和维生素E的测定方法。本标准适用于食品中维生素A和维生素E的测定。本标准检出限分别为，V，0.8ng川-E，91.8ng，E，36.6 ng , a-E , 20. 6吨。第一法高效液相色谱法2 原理GB/T 5009.82-2003 试样中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色i曹C1S反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。3 试剂3.1 元水乙酷2不含有过氧化物。3. 1. 1 过氧化物检查方法:用5mL乙酷加1mL 10%腆化

4、拥溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离腆，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉溶液，水层呈蓝色。该乙隧需处理后使用。3. 1. 2 去除过氧化物的方法z重蒸乙隧时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许。弃去10%初饱液和10%残馆液。3.2 元水乙醇:不得含有隆类物质。3.2.1 检查方法:取2mL银氨溶液于试管中，加入少量乙酶，摇匀，再加入氮氧化锅溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有酸。3.2.2 脱醒方法g取2g硝酸银溶于少量水中。取4g氢氧化销溶于温乙醇中。将两者倾人1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天(不时摇动，促进反应)，经过滤，置蒸馆瓶中蒸馆，弃去初蒸出的50mL.当乙醇中含醒较多时

5、，硝酸银用量适当增加。3.3 元水硫酸锅。3.4 甲醇=重蒸后使用。3.5 重蒸水2水中加少量高锺酸饵，临用前蒸馆。3.6 抗坏血酸溶液(100g/L) ，1临用前配制。3.7 氢氧化梆溶液。+1)。3.8 氢氧化锅溶液(100g/L)。3.9 硝酸银溶液(50g/L)。3.10银氨溶液:加氨水至硝酸银溶液(3.9)中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加氢氧化纳溶液。.8)数漓，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。3.11 维生素A标准液视黄醇(纯度85%)或视黄薛乙酸醋(纯度90%)经皂化处理后使用。用脱应乙醇榕解维生素A标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准

6、确浓度。3.12 维生素E标准液z生育盼(纯度95%)，y生育盼(95%)，a-生育盼(纯度95%)。用脱醒乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg。临用前用紫外分光光度计分别标定此三种维生素E溶液的准确浓度。593 GB/T 5009.82-2003 3.13 内标溶液g称取苯并eJ诧(纯度98%).用脱醒乙醇配制成每1mL相当10g苯并eJ蓝的内标溶液。3.14 pH114试纸。4 仪器与设备4.1 实验室常用仪器。4.2 高效液相色谱仪带紫外分光检测器。4.3 旋转蒸发器。4.4 高速离心机。4.4.1 小离心管=具塑料盖1.5 mL3. 0 mL塑料离心管(

7、与高速离心机配套)。4.5 高纯氮气。4.6 恒温水浴锅。4. 7 紫外分光光度计。5 分析步骤5.1 试样处理5. 1. 1 皂化准确称取1g10日试样(含维生素A约3问，维生素E各异构体约为40g)于皂化瓶中，加30mL元水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL 10%抗坏血酸，苯并eJ花标准液2.00mL.混匀。10mL氢氧化饵(1十1)，混匀。于沸水浴回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。5. 1. 2 提取=将皂化后的试样移入分液漏斗中，用50mL水分2次3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙隧分两次洗皂化瓶及其残渣，乙酷液并入分液漏斗中。如有残渣

8、，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。5. 1. 3 洗涤用约50mL水洗分液漏斗中的乙磁层，用pH试纸检验直至水层不显碱性(最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加)。5.1.4 浓缩将乙隧提取液经过无水硫酸销(约5g)滤入与旋转蒸发器配套的250mL300 mL球形蒸发瓶内，用约100mL乙酷冲洗分液漏斗及无水硫酸饷3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55C水浴中减压蒸馆并回收乙酶，待瓶中剩下约2mL乙酷时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙隧。立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。5. 1. 5 将乙醇液移入一小塑料离心管中(4

9、.4.1)离心5min( 5000 r/min)。上清液供色谱分析。如果试样中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并记下体积比。5.2 标准曲线的制备5.2.1 维生素A和维生素E标准浓度的标定取维生素A和各维生素E标准液若干微升，分别稀释至3.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算出该维生素的浓度。测定条件如表1所示。表1标准加入标准液的量比吸光系数波长V/L E! /nm 视黄醇10.00 1 835 325 生育盼100.0 . 71 294 生育酣100.0 92.8 298 B生育盼100.0 91. 2 298 浓度计算按式(1

10、)594 式中A 1 3.00 =X.X一一一一一E 100 V X 10- c, 维生素浓度，单位为克每毫升(g/mLl; A 维生素的平均紫外吸光值;V 加人标准液的量.单位为微升(L);E 某种维生素1%比吸光系数;JJL 标准液稀释倍数。VX10- 5.2.2 标准曲线的制备GB/T切09.82-2003.( 1) 本标准采用内标法定量。把一定量的维生素A，a生育盼、R生育盼、8生育酣及内标苯并eJ琵液混合均匀。选择合适灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程70%.为高浓度点。高浓度的1/2为低浓度点(其内标苯并eJ蓝的浓度值不变)，用此种浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图(图1)

11、。维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制，或计算直线回归方程。如有微处理机装置，则按仪器说明用二点内标法进行定量。3.55A(视黄醇)5.12 E-B内际10.24 -E(一生育酷12.11-E(生育盼S丁op图1维生素A和维生素E色谱图本标准不能将-E和E分开，故-E峰中包含有-E峰。5.3 高效液相色谱分析5.3.1 色谱条件(参考条件)5.3. 1. 1 预柱，ultrasphereODS 10m，4mmX4.5 cm。5.3. 1. 2 分析柱ultrasphereODS 5m，4.6 mmX25 cm。5.3. 1. 3 流动相s甲醇十水

12、=98十20混匀。临用前脱气。5.3. 1. 4 紫外检测器波长，300nm。量程0.0205.3. 1. 5 进样量，20L。5.3. 1. 6 流速，1.7 mL/min。5.4 试样分析取试样浓缩液20L，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。5.4.1 定性:用标准物色谱峰的保留时间定性。5.4.2 定量:根据色i曾因求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查到其含量。或用回归方程求出其含量。595 GB/T 5009.82-2003 6 结果计算见式(2)。式中2100 X=-XVx一一-.( 2 ) m 1 000 X 维生素的含量，单位为毫克每百克(m

13、g/100g) , c 由标准曲线上查到某种维生素含量，单位为微克每毫升(g/mL), V 试样浓缩定容体积，单位为毫升(mL);m 试样质量，单位为克(g)。计算结果表示到三位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第二法比色法8 原理维生素A在三氯甲;境中与三氯化镑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该蓝色物质虽不稳定，但在一定时间内可用分光光度计于620nm波长处测定其吸光度。9 试剂除非另有说明，在分析中仅使用确定为分析纯的试剂和蒸馆水或相当纯度的水。9.1 无水硫酸锅。9.2 乙酸E干。9.3 乙醋。9

14、.4 元水乙醇，9.5 三氯甲统:应不含分解物，否则会破坏维生素A。9.5.1 检查方法z三氯甲烧不稳定，放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢和光气。检查时可取少量三氯甲烧置试管中加水少许振摇，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银液，如有白色沉淀即说明三氯甲烧中有分解产物。9.5.2 处理方法z试剂应先测验是否含有分解产物，如有.则应予分液漏斗中加水洗数次，加元水硫酸销或氯化钙使之脱水，然后蒸馆。9.6 三氯化锦三氯甲烧溶液(250g/L) ，用三氯甲烧配制三氯化锦溶液，储于棕色瓶中(注意勿使吸收水分)。9.7 氢氧化何溶液(1十1)。9.8 维生素A或视黄醇乙酸酶标准液:同3.11，其标定方法同5

15、.2.1。9.9 酣睡t指示剂(10g/L):用95%乙醇配制。10 仪器10.1 实验室常用仪器。10.2 分光光度计。10.3 回流冷凝装置。GB/T 5009.82-2003 11 分析步骤维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。11. 1 试样处理根据试样性质，可采用皂化法或研磨法。11. 1. 1 皂化法适用于维生素A含量不高的试样，可减少脂溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素A损失。11. 1. 1. 1 皂化.根据试样中维生素A含量的不同，准确称取O.5 g5 g试样于三角瓶中，加入10mL 氢氧化梆0+1)及20mL40 mL乙醇，于电

16、热板上回流30min至皂化完全为止。11. 1. 1.2 提取2将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣子，可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内。用50mL乙隧分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30mL乙隧分二次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，隧层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止。11. 1. 1. 3 洗涤2用约30mL水加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后，放去水层。加15mL 20 mL O. 5 mol/L氢氧化何溶液于分液漏斗中，

17、轻轻振摇后，弃去下层碱液，除去隧溶性酸皂。继续用水洗涤，每次用水约30mL，直至洗涤液与酷lt:指示剂呈无色为止(大约3次)。腿层液静置10min .-._, 20 mn，小心放出析出的水。11.1.1. 4 浓缩将酷层液经过元水硫酸纳滤入三角瓶中，再用约25mL乙酷冲洗分液漏斗和硫酸纳两次，洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馆，回收乙隧。待瓶中剩约5mL乙隧时取下，用减压抽气法至于，立即加入一定量的三氯甲烧使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内。11. 1.2 研磨法适用于每克试样维生素A含量大于5月lOg试样的测定，如肝的分析。步骤简单，省时，结果准确。11. 1.2. 1 研磨g精确称2g5 g

18、试样，放入盛有3倍5倍试样质量的元水硫酸纳研钵中，研磨至试样中水分完全被吸收，并均质化。11. 1. 2. 2 提取2小心地将全部均质化试样移人带盖的三角瓶内，准确加入50mL1mL乙E撞。紧压盖子，用力振摇2min，使试样中维生素A溶于乙酷中。使其自行澄清(大约需1h2 h)，或离心澄清(因乙隧易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装乙酷的试剂瓶也应事先放入冷水浴中)。11. 1. 2. 3 浓缩=取澄清的乙酷提取液2mL5 mL，放入比色管中，在700CWC水浴上抽气蒸干。立即加入1mL三氯甲烧溶解残渣。12 测定12.1 标准曲线的制备准确取一定量的维生素A标准液于45个容量瓶中，以三氯甲烧

19、配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烧和标准系列使用液1mL，各管加入乙酸所1滴，制成标准比色列。于620 nm波长处，以三氯甲:皖调节吸光度至零点，将其标准比色列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锦三氯甲:皖溶液。于6s内测定吸光度，以吸光度为纵坐标，维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图。12.2 试样测定于比色管中加入10mL三氯甲炕，加入1滴乙酸西干为空白液。另一比色管中加入1mL三氯甲:烧，其余比色管中分别加入1mL试样溶液及1滴乙酸西干。其余步骤同标准曲线的制备。597 GB/T 5009.82-2003 13 结果计算见式(3)。一AU-n 1-I X v x c-m x ( 3 ) 式中:X一一试样中维生素A的含量(如按国际单位，每l国际单位=0.3E维生素A)，单位为毫克每百克(mg/100g) ; c一一由标准曲线上查得试样中维生素A的含量，单位为微克每毫升(g/mL); m一一试样质量，单位为克(g);V 提取后加三氯ij3烧定量之体积，单位为毫升(mL);100 以每百克试样计。计算结果保留三位有效数字。14 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。598