NB SH T 0860-2013 液体燃料中活细菌和真菌计数的试验方法过滤和培养程序.pdf

1、ICS 75. 160. 20 E 31 因B/髓/T0860-2013 S锦圈也据practicefor e盟国幽.er捕。盟。Ifviable bacteria a旦遇最翻霹i隐匿q时d盘腿Is一睡在ra笛盟怠圆dc回E每Jreproc罐回res201 载有3四10-01实施NB/SWT 0860-2013 自甘吕本标准使用重新起草法修改采用美国试验与材料协会标准ASTMD6974 - 09 液体燃料中活细菌和真菌计数的试验方法过滤和培养程序。本标准与ASTMD6974一09的结构差异参见附录A，本标准与ASTMD6974一09的主要技术差异及其原因如下:一一删除了ASTMD6974 -0

2、9中1.5条有关国际单位制说明的内容，因我国均采用国际单位制单位;一一删除了ASTMD6974 -09中1.7条，将其安全方面的内容作为警告列于首页标题下;一一关于规范性引用文件，本标准做了具有技术性差异的调整，以适应我国的技术条件，调整的情况集中反映在第2章规范性引用文件中，具体调整如下:增加了GB/T4756石油液体手工取样法;用修改采用国际标准的国家标准GB/T6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法代替ASTM D1 193; 删除了ASTMD6974 -09引用标准中的ASTMD1129、ASTMD4175、ASTMD6426、ASTMF1094 ，因标准正文中并未涉及;增加

3、引用了ASTMD3508、ASTMD5245 (见附录B); 一一增加了有关术语和定义内容:菌落、灭菌、培养、培养基、细菌、真菌、霉菌、异养菌(见3. 1. 2 - 3. 1. 9) ，以增加分析人员对微生物方面知识的认识;一一在第7章仪器中增加了菌落计数器(见7.14)，以方便计数;在第7章仪器中增加了0.2m滤膜(见7.15)，在标准中多次用到，但ASTMD6974 -09并未列出;一一删除了9.3.2中有关过滤方法A的内容，目前国内没有生产该仪器。将ASTMD6974一09标准中的方法B及方法C在本标准中作为方法A、方法B列出;一一删除了第12章关键词部分，因其不属于我国标准的内容;根据

4、ASTMD7464 -08增加了附录B(规范性附录)生物学试验用液体燃料手工取样实施规程，以方便标准使用。为了使用方便，本标准还对ASTMD6974 -09做了如下编辑性修改:一一增加了附录A(资料性附录)本标准章条编号与ASTMD6974一09章条编号对照;一一增加了附录C(资料性附录)微生物污染的来源及防控。本标准由中国石油化工集团公司提出。本标准由全国石油产品和润滑剂标准化技术委员会石油燃料和润滑剂分技术委员会(SAC/TC280/ SC1)归口。本标准起草单位:中国石油化工股份有限公司石油化工科学研究院。本标准主要起草人:赵丽萍、陶志平、张韩。NB/SI王IT0860-2013 液体燃

5、料中活细菌和真菌计数的试验方法过滤和培养程序警告:本标准涉及某些有危险的材料、操作及设备，但并未对所有的安全问题提出建议。因此，用户在使用本标准前应建立适当的安全防护措施，并确定相关规章限制的适用性。1 范围本标准规定了采用膜过滤对常温条件下运动站度不大于24mm2/s的液体燃料的异养菌和真菌进行检测和计数的方法。本标准适用于液体燃料。注:本标准中的定量测试的试验部分主要来自IP385及ASTMD52590 本标准可在现场或实验室进行操作。个体微生物在特定培养基上形成菌落的能力取决于计数菌种的分类学和生态学状态，培养基的化学性质以及培养条件。因此，测试结果不应作为对绝对数值的解释，而应根据AS

6、TMD6469与其他的参数一同作为诊断和环境监控的一部分。本标准提供了将燃油样品中的微生物转移到薄膜上的过滤方法、过滤体积、稀释过滤、微生物所用的培养基以及培养温度等多个选择方案，试验的灵活性使得诊断过程简单化。当本方法用于状态检测时，应始终选择一个相同的规程进行。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。方法GB/T 4756 石油液体手工取样法(GB/T4756-1998 , eqv ISO 3170: 1988) GB/T 6682-2008 分析实验室用

7、水规格和试验方法(ISO3696: 1987 MOD) ASTM D3508 水膜过滤粪大肠菌群的评价方法ASTM D5245 微生物分析用清洁的实验室玻璃器皿，试验器血和设备ASTM D5259 通过膜过滤过程对肠球菌进行分离和计数的测试方法ASTM D6469 燃油和燃油系统微生物污染的标准指南ASTM D7463 燃油中、燃油与水混合体系及燃油携带水体系的微生物系统中三磷酸腺背含量测试ASTM D7464一08生物学试验用液体燃料、相关材料和燃料系统元件的手工取样实施规程ASTM E1326 用于细菌计数的非常规微生物试验的评定指南IP 385 沸点小于390C的燃油和馆分油中好氧菌含量

8、的测定过滤和培养方法3 术语、定义和缩略i吾下列术语和定义、缩略语和符号适用于本文件。NB/SHlT 0860-2013 3. 1 术语和定义3. 1. 1 无菌的不含活3.1.2 菌落微生物在固体基质上生长繁殖形成的肉眼可见的、具有一定形态特征选自NY/T1113-2006 微生物肥料术语J3.1.3 灭菌悦erilization应用物理或化学方法杀灭或清除一切微生物的措施。选自NY1T1:113-2006 微生物肥料末语J3.1.4 气吁:培养创立iiiltion在适宜条件下，使目的微生物生长繁殖和产生代谢产物的方法和技术。选自盯/:T1113-2006飞语虽辅臣揭示:吾J个3.1.5 培

9、养基culture mediu酿白人王配制的适合微生物生长、代谢、繁殖矛!l保存的营养基质。:选自NY/T1113-2006微生物肥料术语. 3.1.6 3.1. 3.2 缩略语3.2.1 CFU colony 菌落形成单位。3.2.2 2 HPC heterotrophic plate count 异养菌的平板计数。3.2.3 真空F呈豆豆C豆主豆brallC起运cr薄膜过滤。3.2.4 3.2.5 3. 4 些位置的样品微生物数量最生长分质的选某种菌落形成而抑制D7463提供了一种才膜过滤的测试方法可以分析的准确度。计数结果可作为诊断或常规监测的一部分，不作为燃料质量指标使用。NB/SI王

10、/T0860一-2013何培养基都会有助于胞的计数结果。ASTM3 NB/Sl王/T0860-2013 6 干扰6. 大量的非生物学的颗粒物沉降(沉淀物)能堵塞薄膜而阻碍过滤。6.2 假定每个CFU产生于单一的微生物细胞，但实际上微生物通常形成聚集体并以单个菌落的方式存在。因此，计数的结果可能会低估最初样品中的总菌数。6.3 微生物个体新陈代谢状态的变化受燃料中很多物理、化学因素的影响。受损的细胞或细胞分裂时间相对长的细胞可能在测试规定的观察时间内不会形成菌落，这会造成最初燃料样品中的总菌数被低估。7 仪器7. 分液漏斗:玻璃制，容量500mLo7.2 量筒:玻璃制，容量100mL和lL。7.

11、3 移液器:玻璃或经过预消毒的一次性塑料制，或使用带有一次性塑料头的可调节体积的移液器，体积lOmL。7.4 过滤薄膜:纤维素1昆合酶，经过预消毒的，网格状优先，直径47mm，孔径。.45mo注:虽然推荐过滤膜材料是纤维素的泪合醋，旦薄膜材料的选择将取决于个人偏好和燃料类型。7.5 过滤器，下面两种过滤器可任选其一:7.5. 消毒注射器:适当容量，带有预消毒的过滤器。7.5.2 过滤器组件:经过预消毒处理的单个或多个的过滤器固定组件，玻璃、不锈钢或聚丙烯材质。注:如果选择真空过滤装置(7.5.2)，应需要一个真空度不超过一66kPa的真空源。7.6 慑子:平头慑子。7. 7 抽滤瓶:足够容量盛

12、装过滤样品及清洗溶剂。7.8 培养皿:预消毒一次性的塑料或玻璃制，直径50mm。注:预先加注培养基的培养皿可以在市场上买到也可以用来替代这里列出的培养皿。7.9 细菌培养箱:可以实现25C:!: 2 c和其他温度的控制(温度在室温至60C可以调节)，视情况选择。7.10 水浴:温度控制在47C士2C，能容纳500mL烧瓶，至少容纳一瓶将使用的琼脂培养基。7.1 玻璃瓶:螺旋盖不漏气的，规格500mL。7.12 培养管:玻璃制，16mm x 125mm具塞。7.13 高压灭菌器:可以容纳垂直放人的500mL玻璃瓶。注:如使用市场上预先加注培养基的培养皿，7.10条-7.13条可以省略。7.14

13、菌落计数器:手动或自动的。7.15 0.2m滤膜:一般由醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚碳酸醋等材料制成。8 试剂和材料8. 1 试剂的纯度:分析纯。8.2 培养基所用的琼脂为生化试剂级。8.3 水:除非另外指出，水的纯度应符合GB/T6682-2008中三级水的规定。8.4 金霉素(氯四环素)水溶液:质量浓度191L。将O.19金霉素溶解在水中并稀释至100mL，通过0.2m滤膜过滤对其进行杀菌。4 NB/SH/T 0860-2013 8.5 清洁剂洛液:质量分数为1%。在990mL水中溶解lOmL聚氧乙烯(20)山梨醇即单油酸酶，杀茵消毒处理可以通过0.2m滤E莫过滤或月1高压灭茵器在12rCy

14、肖奇lSmin实现。8.6 盐酸溶液:浓度为lmoVL。8. 7 乳酸水榕液:质量浓度为100glL。在水中溶解lOg乳酸，用水稀释至100mL，通过0.2m滤膜过滤对其进行消毒。8.8 麦芽浸出液琼脂(MEA)制备:8.8.1 组成如下:麦芽榨出物30g 蛋白陈5g 琼脂15g 水lL8.8.2 准备:麦芽榨出物，蛋白陈以及琼脂在lL水中煮沸，使其溶解。使用盐酸(见8.6)或氢氧化铀(见8.10)调节pH到5.4士0.2。取其中250mL加入到500mL玻璃瓶(见7.11)。用高压灭菌器在121c士2C对其进行lOmin的消毒处理，取出冷却并保持在温度为47C:t 20C的水浴中。或者，在琼

15、脂冷却到47C土20C时，向每100mL的MEA溶液中加人lmL金霉素水溶液，摇动使其1昆合均匀。如果介质要求的丑H值为3.5，则通过添加lOr的乳酸水溶液，进行调节。一旦酸化，MEA将不能重新加热。通过向培养皿中倒人MEA形成一个大约4mm厚的膜来制作琼脂平板，允许冷却成型。注:MEA以脱水或预先加注成型的含有抗生素的或不含抗生素的培养基，都可以从不同的制造商处得到。当对购买的脱水MEA培养基进行消毒处理时，应根据使用说明进行操作，避免过热。注2:对使用MEA以外的其他培养基，应证明测试样品中的细菌在替代培养基上的生长数量有可比性。注3:可以选用其他的抗生素但需要确认抗生素能够抑制酵母菌和霉

16、菌以外的其他细菌的生长。8.9 114强度林格氏液制备:8. 9. 1 组成如下:氧化铀2.25g 氧化饵0.10元氧化钙O. 12g 碳酸氢铀0.05g 水lL8.9.2 准备:将上述盐组分溶解到lL水中，然后分配lOmL到培养管中，通过高压灭菌器在121c消毒15mino注:1/4强度的林格氏液可以以片剂的形式从市场购买。8.10 氢氧化铀溶液:质量浓度为100glL。在水中搭解lOg氢氧化锅，并稀释至100mLo8.11 膜酷陈大豆琼脂(TSA)制备:8. 11. 1 组成如下:膜蛋白陈15g 大豆蛋白陈元氧化纳5g 琼脂15g 7 lL 8.11.2 准备:把上述组分加入到lL水中，加

17、热使之溶解。取其中的250mL加入到500mL具塞玻璃瓶中(见7.11)，通过高压灭菌器在121c士2C泊毒lOmin，取出冷却并保持在温度为47C土2C的水浴中。提取试样进行pH值测定，如果pH值不在7.3:t 0.3范围内，丢掉此溶液3重新配制新的混合液。培养基琼脂板是通过向培养血中倒人足量的TSA制成一个厚度为4mm的膜，冷却凝固成型制得。5 NB/SI王/0860-2013、飞，取样设备与试样接和装置都应进行处理，使所。oc 50C冷藏储存，避免冻结样jil三已经10 样品准备11. 1.2.3 用于轻轻地压消毒注射器(见7.5.1)的柱塞4推动试样进入带刻度的接收容器中(见7.2NB

18、/SI主/T0860-2013 11. 11. )放置到过滤 1. 1.2.4 用清洁剂，出。用注射器取10mL清11. 1.2.5 过滤器冲洗:重新接上过滤器，对11. 1.3.2 11. 1.3.3 8.5)。见11.2 )的菌落11.4.2 根据TSA计算每升试样中真菌、，/唱AJE、式中:N一一每升试样CFU的数量;cc一一在培养血中菌落的数量，见11.4. 1 ; 7 NB/SI王/0860-2013V一一过滤试样的体积，单位为毫升(mL)。11.4.3 如果对试样进行多次试验，计算结果的平均值和标准偏差。1 . 4. 4 如果培养皿上没有菌落，设定cc斗，计算N，并且报告结果细菌1

19、 X 103个/旷;飞意防止皮脆的微生物区系对试样的污染。带应用手套胃，将皮肤气取样装置及样品罐之间进行隔离。于套应是新更换或用浓度为700毛的乙醇冲洗过的。一二、:气B.4.1.2 取样装置会在取样后引人残留。B.2. 1 11-j;二t程最小程度地lr(;p了交叉污染的风险。在取样进行之前对装置消毒，以减少空气传播细菌的污染。所有的试样会接触的界ITf都要进行消毒。在取样之后，将样品转人样品罐之前，擦拭取样器外表菌的碎屑并用乙醇对漏斗的内表面进行消毒。B.4.1.3排液管和阀门取样:做生物测试也可通过管线进行取样，如果是通过液体管线或喷嘴处进行取样，清洗试样流出口并用乙醉:进行擦拭。B.

20、4.1.4 在职林管线连接好之前了取样容器应直保持关闭状态、;芥应在取样结束fl;j立即关闭盖子。这可以减夕空式在子及样ifi啤处理过程1:1:1污染物的引人。B. 4. 21 羊岛的变质:微生物是洁的有机体，因此周?母行微生物测出的样Jjil容易变景。微生物试验最好;在联样后可411内进行。如果测试可在4h内进行，则只窜常提保存样品。如果样品不能在4h内进行试验J则需将样品保存在陌:露了结局n-容器中，容器中耍敢言丘装;或;若是在冰箱中5PC-lQOC进行储存。注:J里愤处理样品，不要使其冷冻，因为冰冻一一熔化这个过程会导致微生物的死L亡cB.5取样过程B. 6. . 1. 1 计量卷尺及铅

21、垂用于测定剩余油料及罐底水的深度。11 NB/SHlT 0860-2013 B.6. 1. 1.2 示水膏用于对油罐内待取石油产品进行水检测。B.6. 1. 1.3 典型的需闭取样器如罔旦1所示7贝勒取梓器如罔R.2所示。取样器的设计应能满足对油罐底部样品的取得。取样器的尺寸、大小应取决于连接管线的内径及所需的样品体积。取样器在油罐中应能够通过液体石油产品及燃油同罐底水之间的界西层。取样器应具有以下特性:一一截面均匀，底部关闭;一一残余油样计量尺，可以取得在油罐的任何截面深度的试样。(0 (a)仰视圈，关闭位置;(b)侧视图，关闭位置;(c)侧视圈，打开位置;(d)仰视圈，打开位置图B.1密闭

22、取样器(功侧视图，阀开启;(b)仰视图，阀开启;(c)照片，盛着燃油和罐底水的贝勒取样器图B.2贝勒取样器B. 6. 1. 1.4 部件:可将取样器中的试样导人到样品罐中。密闭取样器，在取样器顶部的塞子处需要有一段线或0圈。贝勒取样器，是用一个典型钩子状的部件来打开底阀的。B. 6. 1. 1.5 漏斗。B. 6.1.2 步骤B.6. 1.2. 1 测定残余油及罐底水的高度，应根据API石油测定标准手册进行:12 NB/SHlT 0860-2013 将铅垂连接到计量卷尺上;一一将示水膏沿着长度方向涂在铅垂上，宽度保持1.5cm; 一一将铅垂缓慢地下降，始终保持计量卷尺垂直，当铅垂接触油罐底部即

23、停止向下放卷尺;一一根据厂商关于示水膏的操作要求，将示水膏在液体中停留一段时间，然后收起计量卷尺，观察干湿界面;记录卷尺总的长度;一一检测铅垂上的示水膏，记录罐底水的高度OB. 6. 1.2.2 根据B.2. 1所述对取样装置及漏斗进行消毒处理。B.6.1.2.3 将干净的、干燥的密闭取样器或贝勒取样器通过端口进入油罐(可以是油罐舱口，计量井、填充管、电子测量井，或者其他油罐顶部装油口，有足够的空间使取样装置通过液面进入油罐底部)直到取样装置碰到罐底或者是到达其他预计取样的深度。注:密闭取样器的取样是由液体压力差导致的取样塞打开，使得取样器装满。因此，取样器可以取得液相或其他物质。如果取祥是为

24、获得在油罐底部和顶部之间垂直部分样品，贝勒型的取样器更适合，这对取得罐底水、罐底乳化层及石油产品界面的样品十分重要。B.6.1.2.4 当取样器装满后，将密闭取样器和贝勒取样器中的样品通过漏斗转移到样品罐中。B.6.1.2.5 根据测试试验的设计，罐底水的微生物试验需要的样品量为200mL-250mL。如果没有从一个取样点得到足够的试样，可以通过氓合两个或者多个试样实现。可以将?昆合试样中的燃油相从取样器中移除，以提供更多的空间收集额外的样品。如果在一个取样点没有得到足够的水样，水相的体积和乳化物的体积在进行组合配制之前应进行记录。在同一位置收集所有子样品，除非淤泥或其他的碎屑干扰取样装置的关

25、闭，取样装置在继续取同一个混和祥之前不需要清洗。B.6.1.2.6 立即关闭取样器并标记样品罐。B.6.2 阀门取样B. 6. 2.1 应用当取样过程是通过油罐的排液管、取样阀门、分配器进行时，阀门取样是可行的。当根据B.6.1所述取样无法实现时，阀门取样可以用来作为非罐底样品闰罐底样品的对比或者作为替代，在油罐底部安装的排液管，死点的样品比其他部分的样品更具有代表性。B.6.2.2 设备B.6.2.2.1 喷溅吸收垫。B. 6. 2. 2. 2 漏斗。B.6.2.3 操作步骤B.6.2.3.1 擦拭阀门，排液管及喷嘴表面，去除可能污染试样的灰尘及碎屑。B. 6. 2. 3. 2 用乙醇对阀门

26、、排液管及喷嘴进行冲洗。B.6.2.3.3 用乙醇冲洗漏斗。B.6.2.3.4 打开样品罐，将漏斗插入，防止污染样品罐的盖子。B.6.2.3.5 打开阀门，排液管及嗤嘴使得试样装人样品罐，取样量小于90%。首先进人的液相是管线中的残留，而不是油罐中的液相。则应在样品进入样品罐之前，先将管线中的液体放掉一定体积到废液瓶中。B.6.2.3.6 关闭阀门，排液管及喷嘴，盖上样品罐的盖子。B.6.2.3.7 根据B.7标记样品罐。B.6.2.3.8 当取样过程结束时，清洗漏斗。13 NB/SHlT 0860-2013 B. 7 试样的标记取样容器在取样结束后上还应包含以下信息:14 一一日期和时间一取

27、样器的C. 1 微生物C. . i 概述NB/SHlT 0860-2013 微生物生长需要水和营养物质，它们聚集在燃油系统中油水存积的位置。水是微生物生长和繁殖最重要的因素，即使微量水也足以支持微生物群体的生长。巳.2微生物生长营养素分组宏盖营养素和微量营养素。宏量营养索包捂破了氢了革7磊、硫和磷，各种微量元素包括钙，锦，铁、镜、锤、铜、钻、镇以:及其他金属，这些元素在燃油中已经存在。燃油系统提供了微生物的星氏和繁殖所需营养物质和水，微生物在燃淄中I伊J!丛生长OC. 1. 3!撤生物f生长的温度 i 微生物污染控制需要设计完整的策略，考虑装置的设计、取样、分析以及微生物污染的预防、解NB/S

28、H/T 0860-2013 决措施等等。好的系统设计应使污染的引人最小化，并能实现水的转移及定期的清理、检测。巳3.2水的脱除巳3.2.1解决的方法是从预防着手，因为微生物的生长需要水分，首先集中、细致地进行脱水处理。巳3.2.2在将水从系统中转移出来之后，从水相中取代表性的试样进行微生物试验。如果结果是肯定的，则证明在系统里存在着微生物的污染问题。进一步进行化学处理、罐清洗或者其他方式解决。C. 3. 2. 3 如果系统的污染程度不高，并且没有其他的结果表明污染，一般脱除水和使用抑菌剂可满足要求。C.3.2.4 脱水不是一个百分之百有效的方法，大多数的罐设计都不能使得水完全脱除。罐底的设计对

29、水的脱除作用很大。平底和凸底的储罐保留的水多，四底的带排水系统的储水少。C. 3. 3 抑菌剂的使用C. 3. 3.1 抑菌剂有毒，使用和处理必须注意安全。巳3.3.2抑菌剂主要有油溶性的、水溶性的及通用可溶的三种类型。巳3.3.3油溶性的押菌剂溶解在泊中，可以通过燃油系统运输。缺点是它们在水相即微生物生长的地方不起作用。巳3.3.4水溶性的抑菌剂在油中是不溶解的，价格低廉，对于不定期排除的罐底水中的微生物污染是最好的。水溶性的抑菌剂不会一直维持在燃油和系统的生物膜界面，它趋向于对罐底水污染控制更有效。C.3.3.5 通用的抑菌剂在燃油相和水相都很稳定。通用抑菌剂可以象油溶性抑菌剂一样可随着燃

30、油系统运输，水溶性使得其在生物薄膜界面和罐底水的杀菌效果同样有效。但相对于前两种抑菌剂市言，价格较高。C.3.3.6 抑菌剂使用的频率及加剂量在燃油系统和抑菌剂产品中应有详细说明。C. 3. 4 油罐清洗巳3.4.1清理旧油罐是一项很艰难的工作，价格昂贵，严重的系统污染需要将罐体和管线同时清洗，并添加抑菌剂进行处理。C.3.4.2 首先是对系统进行添加抑菌剂，杀菌处理表面生物膜，使系统内壁上的杂质脱落到罐底;接下来是系统内部清理，并验收是否达到要求。巳3.4.3在清理后，对燃油系统进行第二次的杀菌处理，这将去除第一次添加杀菌剂没有到达的地方。如果，储罐中的燃油在清理油罐时被转移了，则将燃料重新

31、加到清理过的储罐之前，应先进行过滤，防止再次污染。巳4数据解释C.4.1 一般认为在储油罐的油相中回收到微生物则证明系统污染严重，而罐底水相的微生物数值从1X 103 CFU/ mL 1 X 105 CFU/ mL，如其他的指标正常，是可以接受的。C. 4. 2 不同的培养基会得到不同的结果，因此，有必要用问样的取样方法、同样的测试过程对系统进行监控。16 的FONlOGOH国的筒Z中华人民共和国石油化工行业标准液体燃料中活细菌和真菌计数的试验方法过滤和培养程序NB/SH/T 0860-2013 中国石化出版社出版发行地址:北京市东城区安定门外大街58号邮编:100011 电话:(010) 84271850 石化标准编辑部电话:(010) 84289937 读者服务部电话:(010) 84289974 ht: / /www.sinopec- E-mail: 北京金明盛印刷有限公司印刷版权专有不得翻印* * 印张1.5字数36千字2014年1月第1次印刷开本880X1230 1/16 2014年1月第1版平书号:155114. 0725 定价:25.00元(购买时请认明封面前伪标识)