GB T 19495.4-2004 转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法.pdf

1、ICS 67.050 B 04 中华人民共和国国家标准GB/T 19495.42004 转基因产品检测核酸定性PCR检测方法Detection of genetically modified organisms and derived products嗣Qualitative PCR methods based on nucleic acid 2004-04-13发布中华人民共相国国家质量监督检验检技总届中国国家际准化管理委员会2004-04“13实施发布GB/T 19495.4-2004 目次前言，1 范围，2 t呈范性引用文件b.13 术语和定义4 防污染措施，三抬样积雪jlj样an 原理

2、7 试弗lj. 2 8 仪器设备.29 检测步骤.2 10 结果判定.，.庐.4 II 结果表述，.4 12 测试报告.444a.4 附录AC级范性附录物种特异性检测方法，5 附录B（姨范！全附录筛选检测方法 . ,. . . 22 附录c（竣范性附录）结构基因特异性检测方法.，32附录D（规范性附录品系将异性检割方法.45 参考文献.，.52 前言GB；19495转基因产品检测事为系列标准2GB/T 19495. 1 2004转基囚产品检测通用要求和定义；- GB/T 1945.2 2004转基因产品检测实验室技术要求$tPCR产物进行确迈s采用实时荧光PCR方法检；那时，扩增及检测同时进行

3、。7试剂7. 1 将PCR反应液分装成小包装警每次取部分进行反应测试，其余溶液保存在一20飞。7.2 模板DNA对！照。7. 3 1Jc 7. 4 dNTP溶液，含有dAP.dCTP,dGTP.dTTPo7. 5 10 PCR 缓冲贯主液。7.6 耐热的DNA聚合酶（T叫重每人7. 7 正向寻物。7.8 反向引物28 仪器设备见GB!T19495. 1 20俏。9 检测步雪景9. 1 一般性要求测试样品中DNA的挺累和含量测定应按照G忌，T19495. 3 20创中的规定执行。每个实验室样品应制备成2个测试样品提敦）只A。测试实验i;z设立PCR抑制J)!J对照，PCR沟制m对照约设置见GB/

4、T19495. l 2004. 对样品进行DJA提取对要保证DNA的主主量积浓度的稳定，以保证PCR反应的可重复性。雯，确保提取的DNA片段大于扩土重片段39. 2 PCR要求和操作9. 2. 1 操作准则具体的位派方法豆豆本标准的附录A至附录Do9.2.2 扩增反应的一般要求反应条件特别是缓离子浓度以及热循环条件要针对每个号i物和体系遂行优化。对于特定的样品首次使用某引物体系时要证实所采用的循环条It不出现竞争性产物以免降低PCR检泌的敏感度。当模幸在DNA分子大于10个拷贝时个标准的PCR反应在40个循环之内就室主得到可检测的PCR产物。随着循环数的治刻，非特异位P民产物也培主目。一个优化

5、的PCR反应要确保运使100个拷爽的参残祥品的目标模板DNA在40个PCR扩治循环内得到可拎测的PCR产物。对于不同的引物要严格控普通其反应温度和1或时阂，同时也要严格控制不同仪器所采用的泛应混合液。9. 3 PCR反应设计9. 3. 1 一簸要求由于不同特异PCR反应结果之间要有可比性，并且在进行复合PCR辛苦竞争PCR检泌对，每个特异PCR之弱会稳互发生作用29. 3.2 扩法片段的大小待扩治目标片段大小的选择/Ji.与研究样品DNA的分子大小相1&11己。主E从主E工食品中得到的变性DNA，扩增产物理想的范围为“七p150七p；对子未经加工部j食品扩增产物片段可以长一些，如：250均左右

6、。只要通过预实验验证能得到大小不向前扩法片段的号I却是可行的，那么这些引物就可应z GB19495.4-2004 用到辛辛品的检罪！L 9. 3.3号i物9. 3. 3. 1 一般要求在附录中绘出了引导每完整的序列信息资料9. 3. 3. 2 号1物设计寻i物设计应该遵循以下要点每个引物长度为18个30个核昔酸，退火温度大约为“，熔解温度豆：65。C;GC/A的比率为自2切，或尽可能接近这个比率；当引辛苦较短时，.降低碱基中G和C的浓度内部i高稳定位）; 3末骂是不存在互补位，以避免引物二聚体；内部没有二级结构没有与检测PCR产物的探针结合主主二聚体的可能znf以使用软件设计引吻。9. 3.

7、3. 3 引物部验证9. 3. 3. 3. 1 一般要求必须证实引物能移扩增其；目标序列。手i物的验证分离步、首先是理论特异性，其次是实验特异注。9.3.3.3.2 理论特异性理论评价至少应该在一个主要的核酸穿列数据库（主n,EMBLGenBank）里进行序列同源性比对（妇FastA, !:last），评价其他生物体是否与该引物具有同源序列。9.3.3.3.3 实验特异性在引辈辈特异性a-：实验评价中，主要是确证引辛却是否有能力区分吕标基因和格近生物的基因序列及I再姓对照c9. 3. 3. 4 对照民、R反rti.需设立至少包括一个阳性对照，一个阴性对照辛苦一个空白试剂对孩，f.骂的设置应符合

8、GH19495. l 20号4烧定。9. 4 PCR捡泌方法的类型卫士转基因产品的定性检泌手在确证号要根据待溅食品的类型和分析要求采取不同的PCR试验。包站立物种特异性检测方法事筛选检测方法：结构特异性检由1万法：品系特异性检湾方法。9.5 PCR反应条件的设置得；录A至墨子录D给出了各种检测方法的反应条件。9.6 扩增产物的检测和确证F苦录A至附录D给出了各种PCR产物检泌的方法c对疏远测试结果为限性的祥品，应对外袁军结构特异基肉或品系将异基因透行送一步检烈。当PCR检测结果为妇it肘，还应通过下列的方法之进行确i!E;月1特异DNA探针进行杂交zPCR产物的限剥性内切酶酶场分析：PCR产物

9、序列j!定z:l GB/T 19495.4-2004 实时荧光PCR方法采用GB19495.5 2004方法：其他验证方法。注如果目标片段牵源于自然存在刻病毒或微生物应通过检滋病毒或微生物基：mil其也序列从而封建哥样品转基因产品还是非转基因产品。f再如，CaMV35S启动子辈自于花善事菜花时病毒，罢王此转基因生物DNA和或1花部菜花叶病毒DNA中幸事有可毒草捡涎ilJCa弘35S启动子如果没有检测到花椰菜花llt病毒的其他序列，那么丐以确定CaM飞735S启动于是漂自于转基医生物。10 结果判定PCR检测对应做孚行实验，两份平行测试祥品约结果应该保持一致。郊果个测试样品的结果为捆住宿另一个为

10、阴性时应重新进行检费i. OJ通过增加PCR反应中DNA的模毅量，使两份平行测试样品的结果一致e济检双目标片段出现扩堪，且PCR产物经过确泣，所有对照结果正常，结果判定为阳性；所检若离目标片段未出现扩增，所有对照结果正常，结果判定为阴性。11 结果表述11. 1 一般襄求实验结果不能用“十”来表述。2月性结果不能用“不含GM。”（“GMnotpresent”）来表述。11. 2 阴性结果的表述测试报告应该包括下列内容z“王才子物称，未捡？划出转基因盖宽分根据（p标准参黑物质，该方法的检测F限为%二英文表述为zFor 只peciesX ,GMO derived material胃asnot de

11、tected. he LOO of the method m % det盯minedwith X X (identify the reference mate口al.”11. 3 限性结果幸亏表运测试报告应该包括下列内容：“对于汉物种，检lJ!出转基因成分。”英文表述为2“ For species ，出epresence of GMO derived material was detected. ” 12 2自试报告按照Gf:l/T19495. 1 2004主运定出莫测试报告。会GB19495.4-2004 陈景A主理范性附录）物种特异性捡源方法A. 1 大豆物转特异性检测方法A. 1. 1

12、范围本方法规定了大豆（Glycline明ax）物矜特异性单拷贝基因序列的常规检测程序。本方法可用来评价从大豆加工产品中提取的DNA的质量，并可判断是否有足量的Dl可A用于转基因成分检测。A. 1. 2原理通过PCR扩增和凝皇室电泳分离可得到大小为118bp的大豆Lectin基因片段GA. 1. 3 检测下限本方法能检测0.1 ng的大豆DNA号A. 1. 4 试剂A. 1.1 一般要求按照。B19495.1 2004的要求执行。A. 1. 4. 2水。A. 1. 4. 3 !OXPCR缓冲液（不含氯化续） A. 1. 4. 4 氯化续溶滚，25mmol/Lo A. 1. 4. 5 dNTP溶液

13、：各2.5 mmol/L. A. 1. 4. 6号物zA. 1. 4. 6. 1 正向引物大豆Leetin基因（Gene！主ank编号，K0082)5 GCC CC TAC TCC ACC CCC AC C3 A. 1. 4. 6. 2 反内引物大豆Leetin基因（GeneBank编号zK00821) 5 GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTGG-3 A. 1. 4. 7 Taq酶，5IU/L, A. 1. 5 仪器A. 1. 5. 1 PCR仪。A. 1. 5. 2 电泳仪。A. 1. 6 PCR扩增A. 1. 6. 1 PCR反应体系本方法中，PCR反应的总体积为25L，

14、反应体系见表A.l。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系P表A.1 PCR反应体系试lflJ 终浓度加样体积严L样品DJA工Cng SU ng : I 在: 15. 9 IOPCR缓冲液（不吉氯化簇）1 5 GB月19495.4-2004表A.1(续7试i!J 终1在凌由日样体积J抖，裹化模溶握主（25四mol/L)L 5 mmol/L I 5 dNTP溶滚(10mmol/L) 。.8 m血。1/1.2 正向引导持。pmol/L)0 2 mo! L 1 反声1引辛苦（5mol/L) I 0 2 mol/L Taq藕C5IU严！.）在5JU 号，1注主qPCR缓冲攘中已经吉在氯化侯，虽

15、氯化续在反应混合攘的终浓度豆豆调整为I.5 mmol儿。A. 1. 6. 2 PCR对照使用具有溯源性刽阳性标准物质作为阳性对照。其他的对孩见GB/T19495. 1 20悦。A. 1. 6. 3 PCR反应参数PCR反应参数见表A.2。使用不同的PCR仪，可对参数千字适当地调整表A.2PCR反应参数预变注10 m阻，95C扩士曾40 5，在oc40 , 72 德环数I 40 最终延停I 3 min句72A. 1. 7 号毒证如果结果只用来评价所提取的D只A的质量是否适用于PCR扩增，要寻根据产生118bp约PCR产物的大小来判断。如果除上述提到约目的外还有其他自始则扩增产物的特异性丐通过采用

16、实时荧光PCR方法，或对扩增产物进行序列辈革定加以确证cA. 1. 8 结果表述如果PCR产物通过电泳通过确证，可表述样品DNA培液中含有来草草于大豆的可扩增的DNA飞飞A.2 番茄物转特异性检政i方法A.2. 1 3塞回本方法规定了检测番茄汀，YDpersicanescuientum Mill. ）物种特异性单拷贝DNA序列的常规程序。本方法可恩来评价从番茄加工产品中提取的DNA的质量，并可判断是否有足量必DNA用于转基因成分检测。A.2.2 原理通过PCR扩增幸在凝胶电泳分吉普可得到大小为126怜的番茄PG基因片段。A.2.3 捡到l下限本方法能检测。.1ng的番茄DNAOA.2.4试剂A

17、.2. 4. 1 一级要求按照GB/T19495. I2004必要求执行。A. 2. 4. 2水。A.2.4.3 10PCR缓冲液不含氯化渎）0 A.2.4.4 氯化续溶挥主，25mmol汀，。A. 2. 4. 5 dNTP溶液，各2.5 mmol/Lo A.2.4.6 引物3A.2.4. 6. 1 正向引物PG基(Gene Bank编号，X04583)5 GCT CGA ATT CT T AA ACT TGT TCT 3乡A. 2. 4. 6. 2 反向弓物PG基因（GeneBank编号X号4583)5 GCA AAG ATG CTC TGA AAA TTA GA 3 A. 2. 4. 7

18、T.q酶，5llJ/1L A. 2. 5仪器A. 2. 5. 1 PCR f义。A.2.5.2 电泳仪。A. 2. 6 PCR扩增A. 2. 6. 1 PCR反应练系GB/T 19495.4-2004 本方法中，只丁R反应的总体积为25L，反应体系见表人3。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系3表A.3PCR反应体系试再l终浓度加样体积L样品DN110 ng 50 ng 1 4飞15 9 i纱XPCR缓冲液不吉氧化篆: 主5氧化续溶液（25mmol/U ! I S m3ol/L I. 5 dITI l哇滚（JO凹mo!L) i 0 8 mmoL矿L2 IE F与寻i物（5，口，o!I

19、.)! 0. 2 pmoVL 反i司引物（5pmol汀，0 2 mol/L Taqfl每（5JU时，）o. 5 JU 。1注主UPCR缓冲滚中已经吉有氧化簇，对氯化续在反应混合液的主要浓度应调整为I.5 mmo/L. A. 2. 6. 2 PCR对照使用具有溯源性前限性标准物质作为陆传对主要。其他的对照见GB/T19495. I 2004, A. 2. 6. 3 PCR反应参数PCR反应参数见表A.4,使用不阔的PCR仪可对参数作适当地调整。表A.4PCR反应参数预变这IO白in.95吃20 s. 95飞、扩主要40 h号cc40 、72飞据写：数40 最终延伸3 min号72CGB/T 19

20、495.4-2004 二是.2. 7 磷证如果结果只用来评价须提取必DNA的质量是否适用于PCR扩增，则根据产生126七p的PCR产物的大小来判断。如果还有涂上面提到的吕的之外电还有其他吕的，则扩增产物的特异性可通过Southern杂交，或采用实时荧光PCR方法，或对扩增产物进行序列泌定加以确证eA.2.8 结果表述如果PCR产物通过电泳通过确证可表述样品DNA溶液中含有来源于番茄的丐扩增的D到AoA. 3 玉米物串串特异性栓蛊I方法1A. 3. 1 范围本方法规定了检测！至米（Zeamays）物科特异性单拷贝淀粉合成酶基因（zSSIIb）序列放常规程序。本方法可恩来评价从玉米加工产品中提取的

21、D:-lA的质量，并可判断是否有足量的D只A用于转基因成分检测aA.3. 2 原理通过PCR扩增和凝呈交电泳分离可得到大小为151怜的番茄zSSIIb基因片段。A.3. 3 检测下限本方法能检测认1n军的玉米DNA。A. 3. 4 试剂A. 3. 4. 1 一般要求按照GB/T19495. l 2004的要求执行bA.3.4.2水。A. 3. 4. 3 lOXPCR缓冲液（不含氯化缓）0 A.3. 4. 4 氯化续溶液，25mmol/L, A. 3. 4. 5 dNTP溶液z各2.5 mmol/L, A.3.4.6寻物2A. 3. 4. 6. 1 正向寻i物zSSIIb基困（GeneBank编

22、号，AF白19297)5 CTC CCA A TC CTTGA CAT CTG C 3 A.3.4.6.2 反向引物乞SSI/b基困（Gene比编号，AF019297)5-TCG A TT TCT CTC TTG GTG ACA GG号A.3.4.7 Taq酶，5IC/fL。A.3.5 仪器A. 3.5. 1 PCR仪。A. 3.5.2 电泳仪。A.3.6 PCR扩增A.3.6. 1 PCR反应体系本方法中，PCR反应的总体积为25fL，反应体系见表A.5。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。8 GB/T 19495.4-20口4表A.5PCR反应体系试ill 终放度加样体校L葬品

23、DNA10吨50ng 本15. 9 lOXPCR缓冲夜不幸氯化簇1 2.5 氯化镶榕液（25mmoVLl l. 5 rnmol/L l 5 d可TP洛攘(10mmol汀，）白，吕西囚。l/L2 正向寻i物（5!mol/L) 止2严白。LILIi问号i物（5Jmol/L) 0 2 mol/L : I Tuq草草飞SJU/ pl.) 0 5 IU : 0. I 注：如PCR缓冲液中已经含有氟化馁，男u氯位接在反应混合滚的终浓度$.调整为I.5 l主imol/L.A 4. 6. 2 PCR对照使用具有孩源性的汩性标准物质作为阪性对，照。其他的对照见GB/T19495. 1-20凶。A. 4. 6.

24、3 PCR反应参数PCR反应参数见表A.8.使用不同的PCR仪，可对参数作适当地调整s10 GB/T 19495.4-2004 表A8 PCR反应参数亲变性0 min,9岳飞二2号S,95 扩增40 s,64 40 s. 72飞二键环数40 最终运f申3皿阳，72A. 4. 7 确证如果结果只用来评价所提取的D.IA的质量是否适用于PCR扩增，则根据产生226坤的PCR产物的大小来判断a奴果除上述提到的吕的之外，还有其他目的，则扩增产物的特异性可通过采用实时荧光PCR方法，或对扩增产物运行序列测定加以确证。A. 4.8 结果表述如果PCR产物通过电泳通过确证，可表述辛辛品DNA溶液中含有来源于

25、玉米的可扩增的DNA,A.5 油菜物种特异性检测方法1A. 5. 1 范围本方法规运了油菜（BrassicaNa pus）物种特异性囚拷贝的磷酸烯醇式丙翻酸竣化魏基因（PE凹的定性PCR检测方法。本方法用于评估油菜及加工产品DNA的质量，并磷定是否存在足够前DNA进行转基因成分分析。A.5.2 原理通过PCR扩增和凝呈交电泳分离可得到大小为121怜的汹菜PEP基因片段。A.5.3 检am下黑本方法能捡型！0. 1吨油菜DNA,A.5.4试li!JA. 5. 4. 1 一般要求按照GB/T19495. 1 2004的要求执行。A. 5. 4. 2 7)(. A. 5. 4. 3 lOXPCR缓：

26、中液不含氯化续入是.5. 4. 4 氯化缓溶液，25mmol/L, A. 5. 4. 5 dNTP溶液各2.5 mmol/L0 A.5. 4.6 引物A. 5. 4. 6. 1 正向引物1窗菜PEP基医（GeneBan社编号：013978)5 CCA GTT CTT GGA GCC GCTGA 3 A.5.4.6.2 反向引物油菜PEP基因（GeneBank编号，013978)5 AAG GGC CAG TCC AAA TGC AGA 3 A.5.4. 7 Taq藕，5IU川，。A.5. 5 仪器A. 5. 5. 1 PCR f立d11 GB/T 19495.4-2004 A.5.5.2 电泳

27、仪。A.5. 6 PCR扩增A.5.6. 1 PCR反应体系本方法中嘈PCR反应的总体积为25L，反应体系见表A.9。可以在不改变试剂浓度的情况下、适当扩大反应体系。表A.9PCR反应体系试剂终浓度如样体积L样品DlA, IO ng 50 ng I I 才i 15. 9 IQPCR缓冲攘（不吉氯化续）I I I z. s 氯化缓搭液（25mmol/L) I I 5 mmol/L I 1. s dNTP洛液10mmol/Ll 0 8 mmol/L I 2 至向寻i物（5,umol汀，）0 2 mol/L I I 主主向号i物（5,umol汀，）0 2 mol/L 了叫酶5JU,L) 0 5 IU

28、 I o. 1 注2如PCR缓冲滚中已经吉布氯化馁，现。氯化续在反应？在台液的终浓度应调整为I.5 mmol!L. A. 5. 6.2 PCR对照使用具有溯源性的阳性标准物质作为限性对烈。其他的对照见GB/T19495. 120悦。A. 5. 6. 3 PCR反应参数PCR反应参数见表A.10。使用不同的PCR仪，可亘古参数作适当地渴整。表A.10 PCR反应参数预变性lO min.95 20 ,95仁、扩增40 s,60飞40 s.72 j盾环室主40 最后的延伸3 min 72C A. 5. 7 确证如果结果只用来评价所提取的DNA的质量是否适用于PCR扩增如l根据产生121bp的PCR产

29、物的大小来判断。主E果除上述提到的吕的之外还有其他目的弯则扩增产物的特异性可通过采用实时荧光PCR方法，或对扩增产物进行序列测定加以确证。A.5.8 结果表述如果PCR产物通过电泳通过确证，可表述样品D到A溶液中含有来源于泡菜的可扩增约DNA0A.6 1渴慕物称特异性检测方法2A. 6. 1 范围12 本方法规定了法菜（BrassirnNa户副物种特异性的单拷贝基因HMGTi Y序列的常震检测程序e本方法可被用来结嚣从油菜部工产品中提取的DNA的质量，并可判断是否有足量的D让Affl t乍转GB/T 19495.4-2004 基因成分分析。A. 6. 2原理通过PCR扩增和凝呈交电泳分离可得到

30、大小为219bp的法菜HMGl/Y基因片段aA. 6. 3 检测下限本方法能检测0.1 ng油菜DNA。A.6.4 试押jA.6. 4. 1 一般要求按照GB/T19495. 1 20饨的要求执行eA.6.4.2水DA. 6. 4. 3 lOXPCR缓冲液（不含氯化缓）0 A.6.4.4 氯化续珞液，25mmol/：刊A. 6. 4. 5 dNTP溶液：各2.5 m阻。l/LA.6.4.6弓i物zA. 6. 4. 6. 1 iEI句号i物？在菜HMGI/Y基因（GeneBank编号，AF127919) 5 ggT CgCCT CCT AAg GCg AAA g 3 A.在.4. 6. 2 反向

31、引物油菜HMGJ/Y基因（GeneBank编号：AF12719)5 gCA ACC ACC Agg CAC CAC3 A. 6. 4. 7 Taq酶：5IU/pL. A.6 5 仪器A. 6. 5. 1 PCR fie A.6.5.2 电泳仪。A. 6. 6 PCR扩增A. 6. 6. 1 PCR反应体系本方法中.PCR反应豹总体积为25L，反应体系见表A.11。可以在不改变试!I浓度的情况下，适当扩大反应体系。表A.11 PCR反应体系试Jlll 终浓度加样体积严.祥品DJA1ng5C ng 水lOXPCR缓冲液不吉氯化装1 2 5 氯化缓珞液（25mmol汀，I 5 mmol/L I 5

32、dNTP摇滚(lOmmol/Ll 0. 8 mmol/L z 正向弓i物（5fIL) I 0 2 lmol/L 反I司引物（5mol/LJ i 0 2 mol!l. . Taq巍（5!U/U I :). 5 !U 。，半注：主ZPCR缓冲液吉有氧化续R应体革中氯化缕的终浓度调整llJI. 5 mmol/L A.7.6.2 PCR对照使用具有溯源性的阳性标准物质作为在日性对照其他剖对照见心HIT19495. 1 2白04.A. 7.6. 3 PCR反应参数PCR f.i.应参数见表A.14。使用不同的PCR仪，可对参数作适当地调整。表A.14 PCR反应参数王卖变性IO min,95C 20 s

33、. 95。C扩增40 s,SOC 全Cs. 72 铺环数4 最终延伸3 onin. 72C A. 7. 7确证加样体积iL如果结果只用来评价所提取的DNA的质量是否适用于PCR扩增，则根据产生216沟的PCR产物的大小来如lj主日果涂上述提到的吕的之外，还有其他吕的，贝1）扩增产物的特异性言：通过采用实对荧光PCR方法或对扩增产物进行序列测定级以魏证。A. 7.8 结果表述主日果PCR产物通过电泳通过确证，可表述样品DNA溶液中含有来源于马铃薯的iiJ扩增的D只A,A. 8 陆地棉花物科特异性检测方法A. 8. 1 范围本方法规定了陆地棉花（Gussy卢iumhirsutum）种特异性的双拷贝

34、SadI基因序列的常规检测程序G15 GB/T 19495.4-2004 本方法可被用来估i!i!从量基地棉花及其主E工产品中提取始DNA的质量，并可判断是否有足量的DNA用作转墓园成分分析q是.8. 2 原理通过PCR扩增和凝呈交电泳分离可得到j大小为107怜的陆地棉花SadI基因片段。A. 8.3 检测下想本方法能检测0.I ng陆地棉基因经m认GA.8.4 试剂A. 8. 4. 1 一般要求按照GB19495.I 20汩的要求执行。A.8.4.2水dA. 8. 4. 3 10PCR缓冲液（不含氯化渎）。A. 8. 4. 4 氯化续溶液25mmoliLo A. 8. 4. 5 dNTP溶液

35、z各2.5 mmol/L A 8. 4. 6号！物A. 8. 4. 6. 1 正向寻i物梅花SadI基因（GenBank编号，AJ132636l5 CCA AAG GAG GTG CCT GTT CA 3 A. 8. 4. 6. 2 反向引物智若花Sadl基因（GeneBank编号zAJ132636l 5 TTG AGGGA GTC AGA ATG TTG TTC 3 A. 8. 4. 7 Taq藕：5IU严L,A. 8.5 仪器A. 8. 5. 1 PCR i义。A. 8. 5. 2 电泳仪。A.8. 6 PCR扩增A.8.6. 1 PCR反应体系本方法中，PCR反应的总体积为25L，反应体

36、系见表A.15。可以在不改变试剂浓度必情况下，适当扩大反应体系P表A.15 PCR反应体系试剂终曹雪度细样f丰积11,L祥品DNA10 ng 50 ng 1 本15.9 10PCR缓冲液不吉氯化续）lX 2三氧化续湾滚（25mmol/LJ l 5 mmol/l. 1 5 dNTP溶攘（0mmoJ!L) 古自由mol/L? 正向弓i物（5mol/U 号2俨mol/Llli向号均t5 umol/L) 击，2,umol/L Tw1毒草心I飞！pLl 0. 5 IU 。1注E如PCR缓冲滚中已经含有氯化侯，要l氯化接在反应混合滚的终浓度Iii揭整为1.5 mmol/L0 A. 8. 6.2 PCR对照

37、使用具有溯源、性的限性标准物质作为隐姓对照c16 GB/T 19495.4一2004其他的对照见GB/T19495. 1 20悦。A. 8.6. 3 PCR反应参戴PCR反应参数见表A.16使用不同的PCRf立可对参数作适当地读整。表A.16 PCR反应参数预变性10 min,95l: ! 20 s,94。C扩增.;o ,5oc 4白s,72 循环数40 最终延伸3 min主72CA. 8. 7 确证如果结果只用来评价所提取始DNA的质量是否适患于PCR扩增，则根据产生107bp的PCR产物的大小来判断a如果然上述提到治吕岭之外，还有其他层的，贱扩增产物治持异性习遂过采用实均荧光PCR方法，或

38、对扩增产物进行序列测定加以确证。A. 8.8 结果表述如果PCR产物通过电泳通过确证，可表述得品D汉A洛液中含有来源于陆地棉花的jjJ扩增刽DNA。A.9 棉层ft物物种特异性检测方法A.9. 1 范自本方法规定了德属（Gossy户可m）物种特异性的桂奉告烯合成草草基因十）d-cadinenesynthase, CADl ClPCR ；.性检测方法。本方法用于评估稳属作物及领工产品DNA的主主量，并确定是否存在足够的DNA进行转基因成分分析。A. 9.2 原理通过PCR扩增辛苦疑胶毫泳分离可得到大小为211!ip躬德蜀植辈辈CADlCl基层片段。A.9.3 捡到下跟本方法能检测。.1 ng穗属

39、植物DNA,A. 9. 4试JA. 9. 4. 1 般要求按照GB/T19495. 1 2古悦的要求执行eA.旦4.2水。A.9.4.3 lOXPCR缓冲液i不含氯化续） A. 9. 4. 4 氯化续溶液：25mmoi/L. A. 9. 4. 5 dNTP溶液二各2.5 mmoi/L. A. 9.4. 6号！物A. 9. 4. 6. 1 正拉1号i牵挂丰富属植物CADlCl基因（GeneBank编号，AF174294)5 GAA C心Acc寸CTACAC TAC A3 A.9.4.6.2 反离引导努棉属植物CADl-Cl基因（Genellank编号：AF174294)17 GB/T 19495

40、.4-2004 5 ACT TGA GATCC CTT GC-3乡A. 9. 4. 7 T叫酶，5IU/11L A. 9. 5仪器A. 9. 5. 1 PCR仪。A. 9. 5. 2 电泳仪eA. 9. 6 PCR扩增A. 9. 6. 1 PCR反应体系本方法中，PCR反应的总体积为2511L，反应体系见表A.17.可以在不改变试剂浓度剖情况下，适当扩大反应体系。表A.17 PCR反应体系试剂终浓度加葬体积iL祥品DNA10 ng 50 ng I 本15 9 ;ox.PCR缓冲穰f不吉氯化簇）1 2. 5 氯化簇溶液（25mmol!L) I. 5unol/L I. 5 d）；F溶液(10mmo

41、l/1) 0 8 mmol/L ! 2 正！再弓i物（二mo!/L)0. 2 fillOliJ : I 反i肯号i物（5 I白。l/L)0. 2 I四oliL! I Taq第（5!UhLl 1 0. 5 JU : 0. I 注。郊PCR缓冲被中已经含有氯化镶，贝u氧化读在反应混合液的终浓度应诺整为I.5 mmo!/L。A. 9. 6. 2 PCR对照使用具有溯源性的泪性标准物质作为期性对照其他的对黑见GB19495.1 2台04.A. 9. 6. 3 PCR反应参数PCR反应参数见表A.18，使用不同的PCR仪，可对参数作适当地调整3表A.18 PCR反应参数预变性10自由，9520 S宇凶扩

42、增30 s.50 45 ,72 循环数i 40 最终延伸: 3古1in,7号u。L A. 9. 7 确证如果结果只用来评价所提取的DNA必质量是否适用于PCR扩增，则援据产生211均的PCR产物的大小来判断。如果涂上述提到的吕的之外，还有其他目的，那扩增产物的特异性可通过采用实时荧光PCR方法或对扩增产物进行序列测定刻以确证。生.9. 8 结果表述郊果PCR产物通过电泳通过确证，可表述样品DNA溶液中含有来源于棉属橙物的可扩增前DNA.18 GB宫19495.4-2004A. 10 真核生物18SrRNA基因检测方法A. 10. 1 范围本方法规定了真核生物内源18SrRNA基因PCR定饺检测

43、方法。本方法适用于评估真核生物DNA的质量，并确定是否存在足够的DNA进行转葱因成分分析。A. 10.2 原理通过PCR扩增秘凝跤电泳分离E夺得到大小为137bp的18SrRNA基131片段。A. 10. 3 检测下限本方法能检测0.1 ng真核生物。NA,A. 10. 4试弗jA. 10. 4. 一般要求按照GB/T19495. 12004部要求执行。A. 10. 4. 2水。A. 10. 4. 3 10 X PCR缓冲液（不含氯化楼LA. 10. 4. 4 氯化缓溶液，25mmol/L。A. 10. 4. 5 dNTP溶液：各2.5 mmol/L, A.10.4.6 引物：A. 10.4.

44、6. 1 正向号物真核生物18SrRNA基因（GeneBank编号z如AK060207)5一CCTGAG AAA CGG CA CCA T 31 A. 10. 4. 6. 2 反向引物真核生物18SrRNA基因（GeneBank编号：如AK060207)5 CGT GTC AGG A TT GGG T AA T-3 A. 10. 4. 7 Taq酶，5IU/L, A.衍，5仪器A. 10. 5. 1 PCR仪。A. 10.5.2 电泳仪。A.10.6 PLR扩增A. 10. 6. 1 PCR反应体系本方法中，PCR反应的总体积为25L，反应体系见袭A.玲。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大

45、反应体系。袭A.19 PCR反应体系试押j终浓度船样体积L样品DNA10吨50ng 1 一水15.9 10PCR缓冲液不含氯化续2. 5 氟化模溶液（25 mmol/L) 1. 5 mmol/L l. 5 二dNTP溶液(JO四mo！O. 8 mmol/L iE向引物（5mol/L) i 0 2阳ol/I反i电寻i物（5mol/Ll 一Taq酶（5llJ/L) 。，5JU 口，I注如PCR缓冲液中已经古有氯化馁，则氯化续在反应混合液的终浓度应调整为1.5 mmol/l叮19 GB/T 19495.4-20号4A. 10. 6. 2 PCR对照使用具有溯源泣的阳性标准物质作为陪性对照其他的对妥善

46、、见GB19495.1 2号悦。A. 1号.6. 3 PCR反应参数PCR /Si.应参数见表A.20。使用不同的PCR仪，可对参数作适当堆满整。表A.20 PCR反应参数预变性10 min.95吃2C s. 95 扩增4G s.54C 40 s. 72 结环数40 最终延伸3 min.72C A. 10. 7确证主自果结果只用来评价所提取必DNA部质量是否适离于PCR扩增，则根据产生137p的PCR产物的大小来判断。主B果涂上述提到的目的之外，还有其他目的，则扩增产物的特异性可通过采用实对荧光PCR方法，或对扩增产物进行序列盖章定郊以确证。A. 10. 8 结果表述主Z果PCR产物通过电泳通过确证，可表述样品DNA溶液中含有来源于真核生物的可扩增的DNA.A. 11 植物叶绿体多拷贝DNA序列检测方法A.11.1 范围本方法规定