SN T 1632.2-2005 奶粉中阪岐肠杆菌检验方法 第2部分 PCR方法.pdf

1、中华人民共和圄出入境检验检疫行业标准SN/T 1632.2-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第2部分:PCR方法Detection of Enter咄actersakazakii from dehydrated powdered milk一Part 2: PCR method 2005-08斗8发布060608000100 2006-02皿01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检痊总局白R 咱啕.-. ._ .-、SN/T 1632. 2-2005 前tR SN/T 1632(奶粉中眼崎肠杆商检验方法分为三个部分z一一第1部分z分离与计数方法:一一第2部分:PCR方法z一一第3部分z荧光

2、PCR方法。本部分为SN/T1632的第2部分。本部分的附录A为规程性附录，附录B为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位z中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人z高旗利、张霞、罗茂黑、张海滨、张海英、赵贵明、姚霞。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I 1 范围奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第2部分:PCR方法SN/T 1632的本部分规定了奶粉中服崎肠杆商的PCR检验方法。本部分适用于奶粉中阪崎踢杆商的快速检验，其他食品可参照执行。2 规范性引用文件SN/T 1632. 2-2005 下列文件中的条款通过SN/T163

3、2本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注臼期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成梅议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。SN/T 1632.1 奶粉中阪崎肠杆商检验方法第1部分z分离与计数方法3 定义、术语和缩路i吾下列术语、定义和缩略语适用于SN/T1632的本部分。3. 1 跟崎肠杆菌Enterobacter sakazakii 阪崎肠杆菌为踊杆菌科肠杆菌属革兰氏阴性无芽抱杆菌，周身鞭毛有动力，大多数产黄色素，具有而葡萄糖背酶活性。3.2 聚合酶链式反应polymerase

4、chain reaction 聚合酶链式反应，简称PCRo使用两段(通常长度为15个25个核昔酸)寡脱氧核昔酸作为反应的引物，这两段寡脱氧核背酸引物的序列应不发生互补作用，但它们可以和称为模板的待扭tlDNA两条链上的特定位点分别发生互补。反应液包括含有镜离子的反应缓冲破、4种脱氧核背王磷酸CdNTP)、模板DNA、引物及热稳定DNA聚合酶组成。在DNA聚合酶催化下，通过温度数十个循环的反复变化CDNA变性、退火及延伸)而获得两个互补位点之间DNA片段的大最拷贝。3.3 缩路诺3.3.1 PCR:polymerase chain reaction，简称PCR。3. 3. 2 DNA: deox

5、yribonuc1eic acid，脱氧核糖核酸。3. 3. 3 dNTP: deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核背三磷暇。3. 3. 4 dA TP: deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺昔二磷酸。3. 3. 5 dCTP: deoxycytidine triphosphate，脱氧胞昔三磷酸。3.3.6 dGTP:deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟背三磷酸。3.3.7 dTTP:deoxythymidine triphosphate，脱氧胸昔三磷酸。3. 3. 8 dUTP: deoxyuridine

6、 triphosphate，脱氧尿昔三磷酸。3. 3. 9 UDG: uracil DNA glycosylase，尿暗脆DNA白糖基酶。3.3. 10 bp: base pair，碱基对。3.3.11 Taq: Thermus aquaticu，水生栖热菌。1 SN/T 1632.2一20053.3. 1四2Tr白is:川tr巾i沁s(仙hy抖droxy严n丑1e眈th均yl)am由n旧1I10m丑1e础e眈tha沮ane始e，三(瓷甲基)氨基申烧。3.3. 1臼3TE: Tris-伊白丑白4 检验方法4. 1 方法提耍奶粉经增菌后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为

7、摸板进行PCR扩增，琼黯糖凝胶电掠检验PCR产物是否有特征条带，从而对奶粉中是否污染阪崎肠杆菌进行快速检验。4.2 试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。4.2. 1 改良月桂基硫酸盐膜蛋白陈肉汤(MLST)(见附录A.l)o4.2.2 脑心浸被(BHl)(见甜录第A.2章)。4.2.3 营养肉汤(NB)(见附录第A.3章)04.2.4 引物z5人GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-3 5人GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG叩34. 2. 5 Taq DNA聚合酶。4.2.6 dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTPo4.2.7 阪崎踊杆嚣质控菌株

8、:ATCC29544 0 4.2.8 琼指糖z分析纯。4.2.9 澳化乙链。4.2. 10 分子最标记:100 bp DNA ladder 0 4.2.11 DNA提取试剂z细菌基团组DNA提取试剂盒。4.2.12 TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1mmol/L EDTA(pH 8.0)。4.2.13 10XPCR缓冲液:200mmol/L Tris-HCl(pH 8.4)、200mmol/L氧化饵、15mmol/L氯化键。4.2.14 5XTBE电泳缓冲液:Tris54 g、础酸27.5g、0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20 mL，加蒸馆水至100

9、0 mL，使用时稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。4.2.15 6X加样缓冲液:30 mmol/L EDT A、36%(体积分数)甘油、0.05%(质量浓度)工申苯腊蓝FF、0.05%(质量浓度)澳盼藏。4.2. 16 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)(见附录第A.4章)。4.2. 17 显色培养基琼脂(Xa-GIcA)(见附录第A.5章。4.3 仪器和设备4.3. 1 天平z章程2峙，感囊0.1g。4.3.2 PCR仪。4.3.3 离心机。A. 3. 4 紫外凝胶成像仪。4.3.5 电泳仪。4.2.6 pH计。4.3.7 移液器:2L10L、10L100L、20L200L、100Ll0

10、00L。4.3.8 恒温培养箱。4.3.9 恒温水浴锅。4.4 检验程序阪崎路杆商PCR检验程序见罔102 SN/T 1632.2-2005 样品100g加到900mLMLST中44C 22 h-24 h 0.2mLMLST增商液加到5mLBHI中36C士1CI 水浴4h PCR检测报告图1阪崎肠杆菌PCR检验程序4.5 步骤4.5. 1 增菌无菌称取奶粉试样100g，加到巳预热的C440C)装有900mL MLST的2L二三角瓶中，振摇使样品充分氓匀后，440C恒温培养22h24 h。在被面1cm以下取MLST增菌液0.2mL加到装有5mLBHI 的小试管中，混匀，360C士lOC恒温水浴4

11、h，水面要高于试管中培养基高度。4.5.2 模板DNA提取取BHI增商液1.5 mL,10 000 r/min离心2min，尽量倒尽上清班。按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA，所提取的模板DNA溶于50LTE中。剩余BHI增菌液360C士lOC假温过夜培养，以备确证试验使用。4.5.3 PCR扩增反应体系体积为50L:10XPCR缓冲液5L、引物对(10mo1/L)各2L，dNTP(10mmo1/L) 1L， TaqDNA聚合酶C5U/L)0.5L、水38.5L模板DNA1L。反应条件:940C预变性5min , 940C变性30s，570C退火30s，720C延伸30s，进

12、行35个循环，720C延伸5min，40C下保存。4.5.4 质控检验过程中要设阳性对照、阴性对照和空白对照。分别接种阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌到10 mL NB中，360C土lOC过夜培养，各取1.5 mL增菌液，离心，提取DNA模板。阪崎肠杆菌DNA模极作阳性对照，金黄色葡萄球菌DNA模板作阴性对照，空白对照加水ILo4.5.5 PCR扩增产物电泳检验用0.5XTBE电泳缓冲破配制1.5%琼脂糖电泳凝胶并趁凝鼓未凝固时加人澳化乙链使其最终浓度达到1g/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过胶面。将7.5LPCR扩增产物分别和1.5L6X加祥缓冲破1昆合，点样，其中一孔加入100b

13、pDNA ladder 0 9 V / cm恒压，电泳20min 30 min。紫外凝胶成像仪下观察电泳结果，却照并记录结果。3 SN月1632.2-20055 结果及!J!IJ甜5.1 PCR扩增产物电珠检验结果阪崎肠杆菌PCR扩增产物为282bpo 5.2 结果判断阴性对照和空白对照均未出现条带;阳性对照出现预期大小的扩增条带;待测样品出现预期大小的扩增条带，怀疑存在阪崎肠杆菌，需进一步确证;待视!样品未出现预期大小的扩增条带，为阴性结果。5.3 确证试验取360C士lOC恒温培莽的相应BHI增菌液接种于VRBGA及X-GlcA中，按照SN/T1632. 1规定，挑取可疑菌落并进行鉴定。5

14、.4 结果表述PCR扩增产物电泳检验结果阳性，且经确证为非假阳性，每100g奶粉中检出阪崎肠杆菌。PCR扩增产物电泳检验结果阴性，每100g奶粉中未检出阪崎肠杆菌。6 庭弃物处理和防止污染的蜡施检验过程中的废弃物，收集后焚烧处理。检验过程中前止交叉、污染的措施参见酣录Bo4 附录A规范性附录)培养基制作A.1 改良月接基础酸盐眼蛋白腺肉汤(MLST)A. 1. 1 成分膜酷陈氧化铀乳糖磷酸氢二挥磷酸二氧锦月桂基硫酸铀万古霉素蒸馆水A. 1.2 制法20.0 g 34.22 g 5.0 g 2. 75 g 2.75 g 0.1 g 0.01 g 1 000.0 mL SN/T 1632. 2-2

15、005 除万古莓素外将各成分加入蒸锢水中，如热溶解，调节pH至6.8土0.201210C高压灭菌15mino 万古霉素配成10mg/mL的溶液，用O.2m的滤膜过滤除菌。i悔用时，取1mL万古霉素溶液加到1 000 mL MLST中。A.2 脑心浸攘(BID)A.2.1 成分辑牛厨牛心多价蛋白且在葡萄糖氧化铀磷酸氢二铀蒸馆水A.2.2 制法200.0 g 250.0 g 10.0 g 2.0 g 5.0 g 2.5 g 1 000.0 mL 将除去结缔组织并绞碎的棋牛脑和牛心肌分别加水各500mL，搅拌，放人40C左右冰箱过夜，次日取出，分别加热至600C700C约30min，再煮沸约1h，搅

16、拌并补充蒸发水分，防止沉渣烧焦。以纱布过滤。再将两液混合于同一容器，并补充水分至1000mL，加入其它成分，适当加热使完全溶解，调节pH至7.4土0.20再适当加热后过滤，分装，1210C灭菌15min。A.3 营养肉汤(HB)A. 3.1 成分蛋白膜牛肉粉氧化铀葡萄糖蒸铺水10.0 g 3.0 g 5.0 g 1. 0g 1 000.0 mL 气.5 SN月1632.2-2005A.3.2 哥哥法将各成分加入蒸馆水中，加热溶解，调节pH至7.4士0.1.分装，121.C高压灭菌15min. A.4 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)A.4.1 成分酵母抽取物蛋白拣氧化铀3号胆盐乳糖中性

17、红结晶紫蒸悔水A.4.2 制法3.0 g 7.0 g 5.0 g 1. 5g 10.0 g 0.03 g 0.002 g 1000.0 mL 将各成分加入蒸锚水中(染料配成1%的水溶液过滤后加入)，加热并不断搅拌至沸腾，使各成分完全溶解，调节pH至7.4土0.1.冷却至45.C倾注直径15cm平板，可放寰2.C8.C冷藏柜保存，4周内使用。A.5 显色培养基琼脂(X伽GlcA): A.5.1 成分蛋白陈牛肉膏氧化铀琼脂丹桂基硫酸钩.5-澳4-氯3巧!噪-D葡萄糖背蒸馈水A.5.2 制法20.0 g 5.0 g 5.0 g 20.0 g 0.25 g 0.08 g 1000.0 mL 将各成分加

18、入蒸馆水中，加热溶解，调节pH至7.3土0.1，分装适当容器，121.C高压灭菌3min. , 6 、因SN/T 1632. 2-2005 附录B(资料性附录)检验过程中防止交叉污染的措施B. 1 抽样和制样过程抽样和市i样工具，必须清洗干净，121.C高压灭菌15min20 min，一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、高压灭商，或为一次性无菌容器。B.2 检验过程B.2.1 PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区和后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从净区到脏区单向进行。B.2.2 实

19、验过程中，必须穿戴实验服和手套，手套要经常更换J各区要有专用实验服，经常清洗。B.2.3 各区所有的试剂、器材尤其是移被器、仪器都应专用，不得带出该区。B. 2. 4 所有溶液、水、辑材和器具要121.C、15min高压灭窟，避免核酸和(或)核酸酶污染。每种溶液必须使用分析纯试剂和新蒸锚的双蒸7(.在20.C25.C贮存的试剂中，可加人0.025%的叠氮化锅。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的最进行贮存。B.2.5 DNA模极或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶oB.2.6 前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加入PCR反应各组分。B.2.7

20、实验前后，实验室用紫外线消毒及通过反复清洗、擦拭去除各种器具和设备表面残留的DNA.B. 2. 8 可使用UDG和dUTP系统控制污染。B.2.9 应遵循PCR操作的其偏要求。mOONiN.NSH在中华人民共和国出入境检验检疫行业标准奶粉中阪崎肠杆商检验方法第2部分:PCR方法SN/T 1632. 2-2005 * 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷9号印张O.75 字数15千字2005年11月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2005年11月第一版9号书号:155066 2-16476 定价8.00元如有!:P装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533SN/T 1632:2一2005