SN T 1961.2-2007 食品中过敏原成分检测方法 第2部分 实时荧光PCR法检测花生成分.pdf

1、F SN/T 1961.2 2007 .，、玉立目c 日日 Detection of allergen components in food一Part 2: Protocol of the real-time fluorescent PCR for detecting peanut component 2007-08-06发布2008-03-01实施才，是2-.- . 发布 d 目。SNj T 1961(食品中过敏原成分检测方法分为两个部分:第1部分:酶联免疫法检测花生成分;第2部分:实时荧光PCR法检测花生成分。本部分为SN/T1961的第2部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口

2、。本部分起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本部分主要起草人:张霞、高旗利、罗茂凰、郑文杰、张海滨、张海英、黎径。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SNjT 1961. 2 2007 I SN/T 1961 .2 2007 品中过敏原成分检测方法第2部分:实时荧光PCR法检测花生成分1 范围SN/ T 1961的本部分规定了食品中过敏原花生成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于检测糕点、糖果、冰祺淋等食品中过敏原花生成分，其他食品可参照使用。2 术语、定义和缩略语2. 1 术语和定义下列术语和定义适用于SN/T1961的本部分。2. 1. 1 实时荧光PCRreaHime

3、 f1 uorescnt , PCR 实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，最后通过荧光信号的增幅进行定性分析。2.2 缩略语下列缩略语适用于SN/T1961的本部分。2. 2. 1 2.2. 2 2.2.3 2.2.4 2.2. 5 2.2.6 2.2.7 2.2.8 2.2.9 2. 2. 10 2. 2. 11 2. 2. 12 2. 2. 13 2. 2. 14 Ct值:C: cycle , T : threshold，每个反应管内的荧光信号到达设定的阔值时所经历的循环数。PCR: polymerase chain reaction

4、，聚合酶链式反应，简称PCR。DNA : deoxyribonucleic acid，脱氧核V口川职。dNTP: deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核昔兰磷酸。dA TP: deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺昔三磷酸。dCTP: deoxycytidine triphosphate，脱氧胞昔三磷酸。dGTP: deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟昔三磷酸。dTTP: deoxythymidine triphosphate，脱氧胸昔三磷酸。dUTP: deoxyuridine triphosphate，脱氧

5、尿昔三磷酸。UDG : uracil DNA glycosylase，尿嘀睫DNA-糖基化酶。bp: bse pair，碱基对。Taq : Thermzquatku，水生栖热菌。Tris: trisC hydroxymethyl) aminomethane，二(捏甲基)氨基甲:院。TE: Tris-HCl、EDTA缓冲液。3 检测方法3. 1 方法提要食品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板进行实时荧光PCR扩增，检测食品中是否存在过敏原花生成分。3.2 试剂和材料除另有规定外，试剂为优级纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。3.2. 1 CTAB缓冲液:55 mmol/L CTAB、1400 mmo

6、l/L氯化铀CNaCl)、20mmol/ L EDT A、100 mmol/L Tris，用10%盐酸CHCl)调pH至8.0，121C，20min高压灭菌，储存于2C8C备用。l -SN/T 196 1.2 2007 3.2.2 TE缓冲液:10 mmol/L Tris、150mmol/L氯化铀(NaCl)、2mmol/L EDT A、1%十二皖基磺酸纳，用10%HCl调pH至8.0 , 121 C , 20 min高压灭菌，储存于2C8C备用。3.2.3 蛋白酶K(20mg/mL)。3.2.4 RNA (5g/L)。3. 2. 5 Tris饱和酣。3.2.6 酣:三氯甲烧=异戊醇(25:

7、24 : 1);三氯甲皖=异戊醇(24: 1)。3.2.7 异丙醇。3.2.8 70 %乙醇。3.2.9 10 mmol/L Tris-HC1(pH9. 0)。3. 2. 10 引物:5-GCAACAGGAGCAAA小小fA r- 3. 2. 11 探针:5(FAM)3. 2. 12 Taq DNA热启动聚合酶。3.2.13 dNTP:dATP、dTTP、3.2.14 10XPCR缓冲液:200 mmol/L Tris-H 化镜(MgC12)。3.3 仪器和设备3. 3. 1 天平:量程2烛，感量O.1 3.3.2 实时荧光PCR仪。3.3.3 冷冻离心机。3.3.4 pH i十。3.3.5

8、移液器:2L10L、10L100L、1003.3.6 振荡器。3.3.7 研钵及粉碎装置。3.4 检测程序过敏原花生成分实时荧光n 品提取实时荧光PCR阴性报告结果。阳性TGGTGCCCT AAGG - 3 Eclipse)-3 l/L氯化铮(KCl)、15mmol/L 图1过敏原花生成分实时荧光PCR检测程序圈, 2 , SN/ T 1961.2 2007 3. 5步3. 5. 1 制样方法称取约200g样品，用洁净研钵或合适的粉碎装置将样品粉碎至粉末状。3.5.2 模板DNA提取3.5.2. 1 CTAB:去称取300mg已制备好的样品至2mL离心管中，加入600LCTAB(若样品吸水性强

9、适当增加CTAB加入量)、40L蛋白酶K，振荡均匀，65C温育30min;加入500L酣:三氯甲:境:异戊醇(25:24:1)，强烈振荡，12000 r/min离心15mirl;吸取上层水相至1.5 mL离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12000 r/min离心10min;弃上清液，用预热至65CTE缓冲液潜解DNA(TE量视DNA沉淀的多少而定);加入5LRNA酶榕液，37C温育30min;加入200L三氯甲:皖:异戊醇(24: 1)，强烈振荡，12000 r/min离心15min;吸取上层水相至新的1.5 mL离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12000 r/min离心10min

10、;弃上清液，加入70%乙醇小心清洗沉淀DNA，12000 r/ min 离心1mil1;弃上清液，干燥，加预热至65CTE缓冲液溶解DNA。每个样品做两个平行样，同时设立试剂提取对照(以水代替样品)。3.5.2.2 商品化试剂盒方法商品化基因组提取试剂盒，使用时按照作说明书进行操作。3.5.2.3 所提取样品DNA的质量评估样品中提取的DNA用紫外分光光度法检测，分别计算核酸的纯度及被度，计算见式(1)、式(2):DNA纯度=OD26 0 nm / OD28 0 nm 比值在1.72. 0之间较好，符合PCR检测要求。3.5. 3 实时荧光PCR扩增3. 5. 3. 1 反应体系双链DNA浓度

11、(g/mL)= 50 X OD260 nm . ( 1 ) . ( 2 ) 10XPCR缓冲液5L、引物对(10mol/L)各2L、探针(10mol/(J-L) 1. 5L、dNTP(1 0 mmol/ L) 1 (J-L、丁qDNA热启动聚合酶(5U/L)0.5L、模板DNAO. 1g2g、补水至50L。3.5.3.2 反应参数1)预变性95C10 min , 1个循环;95C15 s , 60C 1 min，同时收集FAM荧光，进行45个循环。3.5.4 质控设进行检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照、提取对照。3. 5. 4. 1 阳性对照以花生DNA为模板或采用含有扩增片段(花生Ar

12、ah2基因序列)的质粒DNA作为模板。3.5.4.2 阴性对照采用非花生成分的DNA作为模板。3.5.4.3 提取对照采用试剂提取对照作为模板。4 结果分析及判定4. 1 基线的设置实时荧光PCR反应结束后进行结果分析时，应设置基线范围。基线范围选择一般在6个15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。l萄值设置原则以阔值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值不出现任何数值为准。1) 不同仪器、不同T叫DNA热启动聚合酶可根据要求将反应参数做适当调整。卜ccnvllnvFHUF k7FUSN/T 96.2 2007 质控标准阴性对照:无荧光增幅现象。提

13、取对照:元荧光增幅现象。阳性对!照:Ct值三三30.0，并且曲线有明显的荧光增幅现象。以上指标有一项不符合均视为此次实验无效。若阴性对照或提取对照出现荧光增幅现象，说明在样品提取或反应体系中存在污染，可能出现检测结果假阳性。阳性对照结果无荧光增幅现象，说明反应体系存在问题，检测可能出现假阴性结果。根据对照结果分析问题，重新检测样品。4.3 结果判定检测样品无荧光增幅现象，并且阳性对照、阴性对照、提取对照结果正常者，可判定该样品中未检出过敏原花生成分。检测样品Ct值40.0，曲线有明显的荧光增幅现象，并且阳性对照、阴性对照、提取对照结果正常者，可判定该样品中检出过敏原花生成分。检测样品Ct值在40.045. 0之间，应重做实时荧光PCR反应。再次扩增后的结果Ct值仍在40. 045. 0之间，并且阳性对照、阴性对照、提取对照结果正常者，可判定样品中检出过敏原花生成分，否则判定该样品中未检出过敏原花生成分。两个平行样中只要有一个样品检测为阳性，即可判定该样品中检出过敏原花生成分。4.2 hiif 书号:155066 2-1 8243 6.00元定价:SN/ T 1961.2-2007 民-一一