YY T 0127.9-2009 口腔医疗器械生物学评价 第2单元 试验方法 细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法.pdf

1、号在1号代替0127.92001会圈圈电喻电可Bg机raluationof medical 2: Test o 口口腔仁i1.0127. -93 口腔材料生物试验方法乙丁0127.2-2009口腔医疗器械生物静脉途径3. 0127.3-1998 口腔材料生物学评价试验4. 0127.4-2009 口腔医疗器械生物学评价0268 2008( 自口物2 :口腔材料，生物试验方法内cu 0127.5-1999 口腔材料生物学评价2 :口腔材科生物试验方法吸性试验6. YY /T 0127. 6-1998 口腔材料生物学评价第2单元:口腔试验物试验方法显性致死7. YY /T 0127.7-2001

2、口腔材料生物学评价第2单元:口腔材料生物试验方法牙髓牙本质应用试验8. YY /T 0127. 8- 2001 日腔材料生物学评价第2单元:口腔材料生物试验方法皮下植入试验9. YY /T 0127. 9-2009 日腔医疗器械生物学评价散法及滤膜扩散法10. YY /T 0127. 10-2009 日腔医疗器械生物学评价第2回复突变试验CAmes试验)2单元:试验方法细胞毒性试验:琼脂扩:试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌11. Y立/丁0127.11-2001牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性临床前评价第2单元:口腔材料生物试验方法盖髓试验12. YY/T 0127. 12-2008牙科学口腔医疗器

3、械生物学评价第2单元:试验方法微核试验13. YY /T 0127. 13 - 2009 日腔医疗器械生物学评价第2单元:试验方法口腔教膜剌激试验14. YY/T 0244-1996 口腔材料生物试验方法短期全身毒性试验:经口途径15. YY /T 0127. 14-2009 口腔医疗器械生物学评价第2单元:试验方法急性经口全身毒性试验16. YY /T 0127. 15 - 2009 口腔医疗器械生物学评价身毒性试验:经口途径本标准为YY/T0127系列标准的第9部分。本标准是对丁0217.9 - 2001 (口腔材料，生物学评价胞毒性试验:琼脂覆盖法及分子滤过法的修订。2单元:试验方法性和

4、亚慢性全2单元:口腔材料生物试验方法结本版标准的技术内容基本等同采用IS07405: 2008 (牙科学一牙科医疗器械生物6. 2条琼脂扩散试验和第6.3条滤膜扩散试验。中的第I 。127.9-2009本标准根据1S07405: 2008重新起草。个别地方进行了少量编辑性修改9使之更具可操作性。修改之处在标准正文的右侧以竖线标出。并增加了资料性附录A和附录B，以便于与1S07405: 2008 比较。本标准与YY/T0217. 9-2001相比?主要变化如下:一一标准名称改为:仁i腔医疗器械生物学评价第2单元:试验方法细胞毒性试验:琼脂扩散法及滤膜扩散法。一一句标准编辑格式进行了改变。一一琼脂

5、扩散法中细胞反应的描述做了改变。褪色指数和降解指数分别分级评价。一一句在滤膜扩散试验中取消了一种珑础酸脱氢酶染色液配制方法。本标准从实施之日起，同时废除并代替YY/T 0217. 9 -2001(口腔材料生物学评价第2单元:口腔材料生物试验方法细胞毒性试验:琼脂覆盖法及分子滤过法。E 本标准出国家食品药品监督管理局提出。本标准由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会(SAC/TC99)归口。本标准由国家食品药品监督管理局北大医疗器械质量监督检验中心负责起草。本标准主要起草人:林红、郝鹏、李盛林、张研。本标准于2001年首次发布。于2008年第一次修订。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:一-

6、YY/T0127. 9-2001 们27.9-20号2 留本标准规定了口腔医疗器械的细胞毒性试验方法:琼脂扩散法及滤膜扩散法。本标准用于检测口腔医疗器械在通过琼脂或琼脂糖扩散后或通过醋酸纤维素滤膜扩散后的非特异性细胞毒性。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件?其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/丁16886.5 医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验(GB/T16886. 5 - 200

7、3 , IS0 10993-5: 1999 , 1DT) GB/T 16886.12 医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品(GB/T16886. 12-2005 ,IS0 10993-12: 2002 , 1DT) YY/T 0268-2008 牙科学口腔医疗器械生物学评价第1单元:评价与试验3 琼脂扩散法3. 1 昌的本试验用于检测口腔医疗器械在通过琼脂或琼脂糖扩散后的非特异性细胞毒性。本试验不适用于不能通过琼脂或琼脂糖扩散的可沥滤物。3. 2 细胞系选用已建立细胞系的成纤维细胞系或上皮细胞系如来源自美国典型菌种保藏中心(ATCC)的细胞系，ATCCCCL1(NCTC clone

8、 929)(小鼠成纤维细胞)或ATCCCCL2 (日ela)(人上皮细胞系等。应在记录中注明细胞系的编码。如适用，还应在记录中注明对选用的细胞系的描述和定义，以及选用合理性的论证。3. 3 培养基9试剂和设备选用符合选定细胞系生长要求的培养基?过滤法灭菌。配制双倍浓度的细胞培养基(2X)，过滤法灭菌。配制3%琼脂或琼脂糖，高压蒸汽灭菌。11备用前制备活体染色液，将1%水溶性中性红存贮液以1:100的比例用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液如Dulbeccos磷酸盐缓冲液稀释。中性红溶液应避光保存。选用直径90mmr-./100mm的培养皿进行细胞培养。3. 4 试样制备试样制备见YY/T 026

9、8-2008第6条。根据GB/T16886. 5的规定，可选用材料浸提液和/或材料本身进行试验。1 a) 固体材料:制光滑以90%士10%c) 液体材料或材料浸提液:吸取0.01mL 其他载体上9注1:合适的惰性模具材料可以是玻璃或聚因氟乙烯CPTFE)。注2:边用的滤纸可从JjJi滤器tljlJ备。3. 5 使用阴性对照9阴性对照和参照材料(见3.6 试验步骤16886. 12)。5 mm 的圆形超1崩i另模具的。如测试9相对纤维滤纸培养细胞直至达到其对数生长期末。用生长培养基配制成2.5 X 105细胞/mL细胞悬液?吸取适量细胞悬液子足够数量的培养盟中?每个培养皿加入10mL细胞悬液。在

10、37C士2C含5%(体积分数)饱和水蒸气环境下孵育24h。如使用了不同的培养条件?应进行论证。将己灭爵的琼脂或琼脂糖在水浴中加热至100C，然后冷却至48C 。将1份琼脂或琼脂糖;与1份新配制的预热至48C的2X生长培养基混合?使琼脂培养基的最终浓度为1X生长培养基。吸出每一培养血中的生长培养基，加10mL新制备的保持在48C的琼脂或琼脂糖培养基。待琼脂或琼脂糖培养基在室温下凝固(约30min)后?如i入10mL中性红活体染色液并在暗处保存15 miw-20 min(有中性红时9培养基应避光保存?否则将损害细胞)。吸除多余的中性红溶液。若适用，每个培养血中放置适量的试祥和对照材料。每个样本间尽

11、量保持合适的距离(20mm)。将培养皿于37C土2C含5%(体积分数)C02的饱和水蒸气环境下孵育24h。每一试验材料至少应检查四个平行样(即:每一试验材料至少检查两个培养皿)。通常在每一培养皿中至少放置两个试祥。若使用了浸提介质?还应放一个浸提介质对照。每个样本尽量彼此远离9并远离培养皿壁。3. 7 评价指标用有显微标尺的倒置显微镜观察试验材料和对照材料的周围褪色区域?并按表1和表2指标计算每一试样的褪色指数和溶解指数。褪色指数描述。试样周围和试样下方未发现褪色1 只在试样下方有褪色2 褪色区边缘距试样边缘小于0.5cm3 褪色区边缘距试样边缘在O.5cm1. Ocm沼围内4 褪色区边缘距试

12、样边缘大于1.Ocm 5 2 小子褪色区面积20%I白细胞溶解褪色区面积20%40%的细胞溶解褪色区面积40%60%的细胞溶解褪色区面积60%80%的细胞溶解2 o 9 2009 的褪色指数和i溶解指数的的四个平行样内才智2 5，则不需重复试验。检测授提液f:l才?应从含试样的浸提介质的的指数。若作为对照的浸提介质的指数中值1，则应选用注:阴性对J!在中细胞层完整，为有效的试验。3.8 摇果评价在结果评价时9应考虑试验中收集的所有信息?尤其是试验与对照组间结果的任何差异。细胞反应是依据至少4个平行试验的褪色指数和溶解指数的中值。应分别根据两个指数按表3对细胞反应进行分级。3 细胞反应褪色指数和

13、溶解指数分别分毅j及细胞毒性说明23 45 细胞毒性说明元细胞毒性轻度细胞毒性中度细胞毒性重度细胞毒性州-0123细胞反应。检测报告中应包含结果评价。注:在对从细胞毒性试验得到的数据进行解释时必须考虑到本i式验系统的局限性;即一个具有细胞毒性的材料，并非不可使用，但考虑材料的具体应用时应对数据进行解释。3. 9 试验记录试验记录中应包括全部操作的记录，所得全部结果以及结果评价所需的其他任何数据。也包括试验材料制备及使用方法的详细情况以及材料的批号(适用时)。4 滤膜扩散试验4. 1 爵的本标准用于检测口腔医疗器械在通过醋酸纤维素滤膜扩散后的非特异性细胞毒性。4. 2 细胞系选用已建立细胞系的成

14、纤维细胞系或上皮细胞系如来源自美国典型菌种保藏中心(ATCC)的细胞系，ATCCCCL1(NCTC clone 929) (小鼠成纤维细胞)或ATCC CCL2 (H ela) (人上皮细胞系)等。应在记录中注明细胞系的编码。如适用，还应在记录中注明对选用的细胞系的描述和定义?以及选用合理性的论证。4. 3 培养基F试剂和设备按3.3规定的方法制备培养基和琼脂或琼脂糖。制备琉王自酸脱氢酶染色液或非特异性水解酶染色液。4.3. 1 玻瑞酸脱氯酶染色;在的制前:先制备珑王自酸脱氢酶存贮液:a) 琉王自酸盐溶液:唬王自酸铀13.饨，pH7.6的0.2mol/L磷酸盐缓冲液100mL; b) 氧化硝基

15、四氮I座蓝溶液:氧化硝基因氮I挫蓝100mg , pH 7.6的0.2mol/L磷酸盐缓冲液100 mL; c) 吩嗦硫酸甲醋溶液:吩嗦硫酸甲酶4mg，新配制的蒸馆水10mLo 3 o 27. 9-2009 取1mL玻王II酸盐溶液9mL 四氮瞠的容液及1mL吩!臻硫酸甲醋溶液混合制备，成琉玉在酸4. 3. 2 非特异性解酶染色液的制用非特异性水解酶染色时，制一乙酸j!j存贮液?即在1mL丙Wi月液中加入5mg 乙酸酿。使用时取20L存贮液加入到100mL磷酸盐缓冲液(如Dulbeccos磷酸盐缓冲液)中。使用标称内径60mm的培养皿进行细胞培养。使用直径47mm1L径0.45m的醋酸纤维素和

16、硝酸纤维素混合滤膜。4. 4 试样制试样制备见0268-2008第6条。根据GB/丁16886.5的规定，可选用材料浸提液和/或材料本身进行试验。a) 团体材料:制成直径约5mm的圆形试样。一面光滑以保证与滤膜紧密接触。试样的重量不超过3.5g。七)困化类的材料:将刚调和的材料填入内径5mm，高2mm的环形模具中。当测试新鲜调和状态的材料时，应在填入材料之前将环形模具置于滤膜上。如测试不同困化时间的材料时，应使材料充填至与环形模具边缘平齐，并在温度(37土2)OC，相对湿度(90土10)%的环境下回化直至试验开始。试样的重量不超过3.5goc) 液体材料或材料浸提液:吸取0.01mL液体子直径

17、为5mm的图形超细棚硅玻璃纤维滤纸或其他载体上，置于滤膜上。注1.合适的惰性模具材料可以是玻璃或聚四氟乙烯CPTFE)。注2:适用的滤纸可从预滤器制备。4. 5 对照样本使用阳性对照，阴性对照和参照材料(见GB/T16886. 12) 0 4. 6 试验步骤培养细胞直至达到其对数生长期末。用生长培养基配制成2.5X 105细胞/mL细胞悬液。在足够数量的培养皿底部放置灭茵的醋酸纤维素滤膜。吸取细胞悬液?于每一培养血中放置6mL。另取一血，加不含细胞的培养液6mL作为空白对照。在3TC土2C含5%(体积分数)饱和水蒸气培养箱中培养24ho如使用了不同的培养条件乡应进行论证。吸取保存在48C的新制

18、备的琼脂或琼脂糖培养基(见3.6)5mL子足够数量的新的空培养血中，并在室温下使其凝固。从经过24h培养含醋酸纤维素滤膜的平皿中吸除多余的生长培养液。用3TC土2C的磷酸盐缓冲液(如Dulbeccos磷酸盐缓冲液)清洗滤膜，取出滤膜，放于琼脂或琼脂糖培养基表面，细胞面朝下。在每一平皿的滤膜上放3，._，5个试样。在含5%(体积分数)COz饱和水蒸气培养箱中于3TC士2C继续孵育培养出和24h。应保证试样与滤膜表面紧密接触。在培养2h和24h后评价细胞毒性。若适用，每个平血中放阳性与阴性对照各一个。另外增设一个含单层细胞但无试验材料的滤膜和一个不含细胞但接触试验材料的滤膜作为空白对照。/4 使用

19、浸提液时，还应设浸提介质对照。每一试样至少有四个平行样(每一试验材料至少检查两个培养皿)。孵育后，去除试样?轻轻将滤膜与琼胳或琼脂糖分开，取出滤膜。可选用下面方法A或方法B用细胞化学方法评价细胞酶活性减少的面积。a)方法A们27.9-2009 按Barka矛nAnderso(1963年)的方法显示琉琅酸脱氢酶活性(酶分类1.3, 99. 1)。用玻王13酸脱氢酶染色?夜浸泡滤)摸?在3TC士2C培养箱中孵育拙。测量前月3蒸锚水冲洗滤膜9注:可将滤摆在111洗前用10%中性甲酸溶液浸泡15min，以固定细胞。b)方法B用二11:特异性水解酶染色液浸泡滤膜9在4C下孵育30min，显示非特异性水解

20、酶。在紫外光下滤膜。4. 7 锢胞损害评价可选用下面a)或b)法评价细胞的损a)测量褪色区面积(如通过图像分析系统)或b)按表4分级。表4细胞损害评价分级滤虞染色观察褪色面积。整个滤膜染色密度元变化元1 染色密度减少区或未染色区的直径小于试样C5mm)7mm40mm2 注:阴性对照样本下方的滤膜及对照滤膜经琉硝酸JlJ1氢酶染色后应呈均匀的深蓝色，经非特异性水解酶染色呈浅绿色。无细胞的对照滤膜可评价试样对滤膜可能产生的影响。4. 8 结果评价在结果评价时，应考虑试验中收集的所有信息，尤其是试验与对照组!可结果的任何差异。按表5对被试物分级。细胞损害指数。检测报告中应包含结果评价。表5被试物分级

21、细胞毒性评价元细胞毒性轻度细胞毒性中度细胞毒性重度细胞毒性注:在对从细胞毒培养试验得到的数据进行解释时必须考虑到本试验系统的局限性;即一个具有细胞毒性的材料，并非不可使用，但考虑材料的具体应用时应对数据进行解释。4. 9 试验记录试验记录中应包括全部操作的记录，所得全部结果以及结果评价所需的其他任何数据。也包括试验材料制备及使用方法的详细情况以及材料的批号(适用时)。5 o A 74号5:2008 本标准章条编号对茧的国际标准章条主席号3 6. 2 3. 1 6.2.1 3.2 6.2.2 3. 3 6. 2. 3 3.4 6.2.4 3. 5 6.2. 5 3. 6 6. 2. 6 3. 7

22、 6. 2. 7 3. 8 6.2.8 3. 9 6.2.9 4 6. 3 4. 1 6.3. 1 L1. 2 6. 3. 2 4. 3 6. 3. 3 4.4 6. 3. 4 4. 5 6. 3. 5 4. 6 6.3.6 4. 7 6.3.7 4.8 6.3.8 4. 9 6.3.9 6 本标准的章条编号3.2 3.3 3.4 3. 6 4. 2 4.4 4. 6 附录B资113性附录刺器与输血插臼ISO 7405: 2008 技术性差异增加举例ATCCCCLICNCTC clone 929) (小鼠成纤维细胞)或ATCC CCL2 (I-I ela) (人上皮细胞系)等取消原文选用6孔培

23、养板(直径35mm)或直径50mr丑100mm的培养皿进行细胞培养。中的6孔培养板(直径35mm)。改为90mm100mm培养皿试样制备由6.1改为yyjT 0268 -2008第6条。中增加或其他载体上在第二段中增加使琼脂培养基的最终浓度为1X生长培养基和保持在48C0 在第四段中增加通常在每一培养盟中至少放置两个试样。若使用了浸提介质，还应放一个浸提介质对照。每-个样本尽量彼此远离，并远离培养皿壁增加举例ATCCCCLICNCTC clone 929) (小鼠成纤维细胞)或ATCC CCL2 (I-Iela) (人上皮细胞系等试样制备由6.1改为yyjT 0268-2008第6条增加另取一

24、皿，加不含细胞的培养被6mL作为空白对照们27.9-2009 因)京医i增加可操作性与后面样品问隔(20mm)描述矛盾。采用国内常用培养皿尺寸与国内标准统一，并参考国内常用材料，增加可|操作性增加可操作性增加可操作性与国内标准统一增加可操作性7 中华人民共和国医药行业标准口腔医疗器械生物学评价第2单元:试验方法细跑毒性试验:琼脂扩散法及滤膜扩散法YY/T 0127. 9一2009-)(-中国医药科技出版社出版发行北京市海淀区文意图北路甲22号邮政编码:100082 网址电话:发行:010- 62227427 邮购:010 - 62236938 三河市腾飞印务有限公司印刷各地新华书店经销-x-开本880X12301/16 印张O.75 字数20千字2011年5月第一版2011年5月第一次印刷 ，、书号:145067 68 定价15.00元如有印装差错由本社发行部调换版权专有侵权必究举报电话:(010)62214756?明白