GB T 16631-1996 柱液相色谱分析法通则.pdf

1、GB/T 11一1前吉本标准是参考日本JISK0124一1983高脚相色情分析通则)以及有关国内、国外资料接GB/T1.1-1993(标准化工作导则第!单元1标准的制与我述规则第!部分l标准编写的基本规定)制定的，日本JISK0124-1983仅仅适用于高脚相叫法，内容简单，本标准适用于植被相色诸法(包括瞅瞅相刨法)，并且增加丁章、条及其相关的内容，本标准的附录A、附和、附录C、附录D、附录t、附录?、附录G、附录H、附录j、附录K、附录L、附录M、附录N、附录P都是提示的附录。本标准由中华人民共和国化学工业部提出。本标准由化学工业部标准化研究所归口，本标准起草单位i化学工业部标准化研究所、天

2、津大学。本标准主要起草人:察建安、赵恨，1 范围中华人民共和回回撤标准柱液相色谱分析法通则General rules for analytical methods of liquid column chromatography GB/T 1 6631 -1 996 本栋准规定了柱液相钮，谐(简称液相侥谐，下问分析法涌则，适用于采用鞭相色谐分析法对无机、有机化合物的定性、定最分析，以及对高分子化合物的分子量的测定的一般要求。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文.本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都舍被修订，使用本标准的各方面应探讨使用下列标准最新版本的可

3、能性.GB/T 900888液相色谱法术谐柱液相色谱法和平面包谱法3 方法栅鹦概相色谱分析法是在柱管内进衍组分分陶的液相包谱法。被体或固体试样用液态流体(榕荆或糟液)作为流动相使其通过色谱桩，由于试样在固定相和流动相中分配系数和其他作用力的整界、或流体力学体积的不同而被分离成各个组分，流功相中的各个组分通过特性检测糟测量以及倍号的记录，根据各组分的保留值、峰高、峰面积带进行定性、定量分析和分子量的测定。4 仪菌概相色谱仪一般由分离、检测、记最等部件组成。如朋1中所示。4. 1 分离部分4.1.1 储液器阁1液柑色谱仪示意罔样储流动相的容糟。有的包括加热辑、搅拌器、真空口和通惰性气体的入口。容精

4、中已侄纯化的流动相，经烧错过谶头(5m)，由囊输送到色谱柱。储流榻的材质不应该被流动相侵蚀和市娘.般应该用玻璃，不锈钢或氟塑料等材质组成。4.1.2泵输送流动相的部件.可以得到所需的服力并能调节及提供稳定的、精确的流量一般是0.1-9.9回靠技术监督局199612嗣02批准1997幡05唰01实施GB/T 16631一1996mL/min).使用于高效液相色谐的泵，可提供0-35MPa的服力。梨街往复裂、住射架、气功泵、蠕动架等。梨体接触流动相的部分不应该被侵蚀和精染以及容易进行流动相的更换。4.1.3 梯度榄脱装置供给二元或多元1隐含榕剂可按需要井连续改变组分配比的部件。梯度恍脱蝶置有两类。

5、4.1.3. 低li系统流动相在常压下海合或流动相经电磁阀按比例进入泵，然后将其输入色谐柱系统。该装置所用的泵应该是内体积小，使流动相在泵内的棍合影响减至最小。如往复泵。4.3.2 高压系统一般将两种流动相分别用来增压，然后注入槐合器中，晦输入住谐柱系统。该楼就所用的槐合糟的体积费尽最小，使在开始进行槐命和在柱的入口处出现梯皮之间只需要很嫂的时间。耀合器应该易于清拙。4.4 进样装置能将试样注入色谱柱的部件。目前使用的有三种方法。4.4. 注射器该法利用微量注射器(或一般注射糟)将真针头穿过技射口处的隔膜直接把试样注入包谐柱。隔膜材料不仅能经受高压，还应对溶剂有良好的稳定性，一般服该使用氟橡胶

6、都片。当压力大于10MPa时，应使用停流进样技术。4.1.4.2 进样问该法利用大通阀和试样环管与包谱系统相连接，用微量注射器将试样注入并部分或究金充满环管，通过阀切换使流动相把环管中的试桦携带入色谱柱。六通阀必须能耐高压。环管一般用不锈钢制成，其体积可从几个微升到几个毫升。对于使用小体积环管时，在阔的出口和色谱柱之间不能有明显的死体积。当更换试样时，应该清洗六通阀，以免前眉不同试样的干扰。4.1.4.3 自动进样器利用机械臂由微处理机控制，能将多个试样准确地、摄现性地自动垃入色谱系统，可以改变试样的处理、进样、分析等条件，进行连续自动分析，也能紧急插入分析。4. ,. 5 柱箱由加热、温度控

7、制及测温元件等组成的容器。能够保持试验时所需要的温度和容纳试瞌所需用的色谱柱。一般柱箱温度的控制精度应在1%之内。在用于体积排除色谐法测定高分子化合物时，有时需要在较高的温度下操作，以增加试样在流动相中的溶解度及降低流动相的帖度。4.6 柱管一般用不锈钢、破璃或其他合成材料等材质制成。必须能承受试验时的操作压力，不与流动相起化学作用，柱管捕净，内璧光滑，附庸饱。玻璃材质制成的柱管通常不能在高于7MPa时使用。目前一般用内径4-8mm、快5-30cm或内径1-2mm、快10-25cm的柱管。柱臂的尺寸应与桩填充剂的颗粒度相匹配。4.2 检测部分4.2. 检测器锥测器有时放置在能保持祖度或高于柱箱

8、温度的容器中。目前使用的概相租谱检测器有两类。总体性能检测器。如法接折光盖在检测器、(激光)光散射检测器、电导率检测糟等。榕质性能检测器。如紫外一可见光检测器、荧光检测器、红外光度计检测糖等。GB/T 663一1996紫外可见光检测糖和示接折光率检测楞是在液相色谱法中常用的二种检测糟。4.2. 紫外可见光检测器对咀度和流速的变化相时地不敏感，对紫外可见光有吸收的试样都能幢测，其检测灵敏度由试样在该检测被长下的吸收系数决定，但在检测器搅妖范围内无吸收的试样则不能检测。选用的流动相必须在检测器所用的被长处无吸收就低吸收，梯度恍脱时，若有微小的吸收，则必须进行背景扣除。用作流动相的溶剂，垃意其紫外截

9、止被快。4.2.2 示楚折光旦在检测器对任何组分的折光率和流动相的折光嘟有维别时都可以使用.检测糯对祖庶的变化和流最的搅动较敏感。流动相组成的改变其折光望在亦随之发生变化，因此，示楚折光率检测糟不能用于梯皮恍脱。4.2.3 二极管阵列检测器。这是采用光电工极管阵列作为检测元仲的紫外一可见光检测器，可以多通道并列检测，或金光谱检测。这种检测糟烹耍特点:一一扫描速度快。可以在不停流的条件下获得恍脱组分的金光谱闹，提供光谱资料，一一利用比较光谱法，判别色谱峰的纯度及分离状况。在色谱峰的前、后附和峰高处各取一点，比较这三个位置的光谱阁，者三个光谱阁兜余相:!配时，说明是纯峰，若不究余阻自己，说明峰中有

10、杂脆p一一能绘制二三维色谱阁。由于扫描速度快，约10ms可以将190-600nm整个光谱抱回扫究，通过三维色谱图能观察到试样中所有组分对被伏的响应筒，又由于每个组分都有企波段的光谱吸收图，因此，可利用色谱保留值规律及光谱特征吸收曲线提高判别恍脱组分的性质的能力。4.2.4 (激光)光散射检测器是测量分子榕液的散射光强度，一般测定商分子物质的分子量。4.2.1.5 荧光检测器能测量某些钮分在紫外光激发下所发射出的荧光，是一种很羡敏和选择性好的检测器。4.2. ,. 6 电化学检测器可以在校流出液中测黛许多浓度很低的具有辄化成还照性、电导性以及一些离子型的组分，是一种有选择性和灵敏性的检测糟。4.

11、2.2 流分收集器用于收集流出液的装置。有手控和自动两种。于控的流分收集器是根据需要分别收集保留值不同的组分于专用的管内。自动的流分收集器是在确定收集保留值不同的组分，按照预定程序遗缩地打开或关闭相应的阔门，使流出液自动流向固定的管内。多次进样时，可以鼓复收集所需组分的流出辙，达到制备纯化试样的目的。收集流剧液一般使用玻璃材质的容器。4.3记录部分4.3. 记录器能够在条状图纸上用记录笔记录色谱图，显乐各组分的色谱峰。4.3.2 数据处理接置积分仪:按时间累积检测系统所产生的电倍号，自动测定峰商及峰面积的数字积分器和打印机。微处理机z通过微处珊机与色谱仪的接口，将色谱倍号及控制色谱仪各部分情号

12、输邀到微处理机。微处理机可以按指令控制一台或多台色谱仪，并处理各种曾借号，进行计算及棺制外部事件。5 流动相在液相色谱中由于流动相分子参与试样分子及固定相分子之间的作用，因此，在液相色谱法中流动相的选择是重要的分离因素。液相色谱法中使用的流动相一般应该满足下列要求:与试样、固定相不发生反应pGB/T 16631 1996 一一不使试样改变性质、而又能梅解试样p一一具有合适的溶剂强度F榕剂沸点应该高于分离掘度20-50C;柏度在分离温度下不越过0.5cP; 一必须与检测糯匹配#一一用作流动相的榕剂(二种或二种以上要互相榕解$一一安全，低辙。5.1 溶剂在施拌流动相时，必须嗜虑溶荆的各种性质。液相

13、色谱法中用作流动相的榕剂的性质，见附录A(提示的附最。5.2 分离度均是值的关系液相色谱法中相邻色谱峰的分离状况，可用分离度来褒征。分离度可用公式(1)表示:R= .j-1 k ( 1 ) -4、(n -a- 十k上式表明分离皮受n(理论极数)、(分离因子)及k(容量因子)二三个独立的因素的影响(对分析一般希望R=1.R=l，两包谱峰之间有2%的重叠，R=1.5，两色谱峰达到基线分离)。柱效.愈高，分离愈好，因此，高放填充荆及有效的柱填充方法菇取得高效色谐柱的关键。是从上面等式中，在n与相同的条件下，RT芋瓦品在1-5之间对R值影响最大，一般在掖相色谐中控制在1-10之间对分离及分析时间都比较

14、合通)，通过调节榕剂的配比，即调节溶剂强度，使组分在此拖围内进行挽脱。藉在此范围内仍有某些组分不能分离，可以保持此合适榕剂强度的情况不，改变流功相性质，达到改变的目的(与试样分子、流动相分子之间相互作用力有关)。5.3 潜剂强度与极性的表示5.3.1 榕剂强度参数(0.用硅股，氧化铝柱填充剂测得。榕剂极性用榕剂强度参数d表示，在。值的大小表示该榕剂洗脱能力的大小，对于试样所有组分来说，增加d值撒眯着榕剂强度的增加和k值的减少。在液剧色谐法中，一般都采用二元榕荆耀合物作为流动相，个溶剂为惰性梅剂，另个为极性稍强的榕荆，倒1昆合腊梅剂强度不虽线性变化.二元溶剂体系的组成与其强度的关系，见附录B(提

15、示的附录)。5.3.2 溶解度参数8.由沸点计算得到。是溶剂极性较好的费示方法，榕荆相对极性的量度。非极性榕刑的S值小，极性溶剂的S值大，溶剂的分子与试样分子之间有相互作用力，即色散作用力品，偶极作用力乱，接受氢质子的能力乱，载质子始于能力8h，一般由8债来推制梅剂蹦度，当k债调节到合增抱回(1k10)之后，根据试样的性质，可以用选择8值相逝，但8d、80、8.、8h值不间的另一种榕荆来改变选择性。5.3.3 溶剂极性参数p。是在榕解皮基础上提出的，因此，在液-液色谱法中p值可以提供一个具有一定精度的榕荆强度的最度。根据分子间的作用力用Xd(质子给予体)，X.(质子接受体)，Xn(偶极矩)来代

16、表梅剂的不同的作用力，并且将常用的溶剂按照选择性分成八个组，见附最C(提示的附族团1)，同一组内的潜剂具有相似的选择性，这样，当儒赘改变选择性时，在同一组内只需选择具有代表性的溶剂即可.正相和反相也谱法中，利用榕剂的选择性三角坐标，见附最C(提示的附最阔幻，可以大大地简化正相相反相色。谱法中溶剂的选择。去给他们仍不能满足端择性要求时，可以考虑使用其他组的梅荆，或者更精细地调节选择性时，可以采用三元溶剂体系，一般可以用基础榕剂浓度调节梅剂强度，用另外二种溶剂撒度比来调节选择性，5.4 1巨相和反相色谱法中用流动相正相色谱法中，柱填充剂一般都具有极性(如硅胶、脯基、二醇基等化学键合相。通常应果用非

17、极性榕剂、短樊榕剂(如正己烧、正庚烧、异事烧等作为基础溶剂，加入适当比例极性较强的溶剂组成1隐含榕剂作为流动相。GB/T 16631 1996 榕剂强度可以通过改变媲合溶剂中极性榕剂的比例来调整。当增大溶剂P值时，榕剂强度增加.试样的k值减少。如品值超过10以后，组分仍达不到所帘的分离度时，可以保持榕剂强度，用选择性-角坐标中提供的不同性质的榕荆来改静包谱峰重叠组分的分离度.反相色谱法中，柱填充剂一般都是非极性的(如键合事基、十八婉基化学键合相).通常应采用极性较强的水作为基础榕剂，加入适当比例句之、混合的极性较弱的潜剂(如甲醇组成混合溶剂作为流动相。溶剂强度一般通过改变加入水中榕荆的比例来调

18、酶，以达到组分的分离。当槽荆P值增加时，溶剂强度会降低，试样的k值增大。着个别组分达不到所需的分离版时，则可以根据分子间不间作用力性质的榕荆来改善，如用乙脯或四载映哺取代甲醇或加入到原来甲醇/水的榕荆体系中以改静分离。二三元的水槽性流动相能对某些分离提供极好的选择性。5.5 离子交换包谱法中用流动相在离子交换色谱法中，流动相常用食盐的水溶液加入适当的改性剂(如甲醇、乙脯)，用镀冲槽液保持所需要的pH值。游剂强度和选择性由以下几种变量决定z镀冲离子和盐的提到和浓度F与水直榕的有机溶剂的费础和浓度，流动相的pH值。流动相的离子强皮影响组分的保留筒，当离子强度增加，溶剂强度亦随之增加，因为流动相中离

19、子的增加导致流动相离子对试样离子在陶子交换位的竟争交换作用增大，致使试样离子加速榄脱。同时，流功相离子的类型对榕剂强度有关，在阴离子交换中，具有相同浓度而不同的流动相阴离子，流动相榕剂强度一般按以下顺序改变z拧糠酸根硫酸根草酸根申酸根乙酸根在阳离子交换中，流动相离子类型的变化也影响榕荆强度，但援别很小，主要是各种阳离子的大小和电荷变化较小，旦有时阳离子类型的变化，可能改变选择性。在离子交换租谱陆中.pH值的变化对试样离子的离子化及柱填充剂的离子化程度都有影响，因此，按制pH值的变化能改变流动相的溶剂强度，也能改变选择性。离子交换色谱法中常用的缓冲剂，见附录D(提浓的附录).5.6 离子对色谱法

20、中用流动相离子对色谱法中可用正相成反相离子对色谱分离系统，般反相分离系统的使用更为广泛。反相分离系统用辛莲、十八烧基化学键合相时，可果用甲醇/水或乙脯/水的调合榕剂作为流动相，在适当的辑冲榕榄中加入与试样分子形成非离子型的离子对.细分的分离随搅动相的pH僚、缓冲榕液的盐离子浓度、离子对试剂烧蒂链的长烧、溶剂的种费以及温度等因素的变化阳改变。生组改变一给定二元组分棍合溶剂的相对撒lf时，端择性的改变通常是很小的，一般通过改变糟剂来改变选择性，而改变流动相的pH值是改静分离选择性的一个很有效的方法。正相分离系统中，丁醇或戊醇与工氯乙烧、三氯甲烧和(或正已婉的棍合榕剂是通常使用的流动相。一般通过改变

21、流动相的组成来改变分离选择性。磷酸四丁荔氟化镜和磷酸四丁荔澳化锻用于酸性化合物)以及戊惋横酸和庚烧确酸用于碱性化合物是常用的离子对试剂。5. 7 离子住谱法中用流动相5.7.1 抑制型一般选择用作流动相的榄脱剂应该是离子型水榕液，能从色谱柱上置换阴、阳离子，并在抑制柱上发生交换反应，使搅脱离子变成低电辱事物质(如水、碳酸挣后再进入咆辱检测系统，从而解决了榄脱剂本身具有很高检测倍号，即背景电辱的干涉。阴雨子分离时，常用碱性搅脱剂，如氮氧化铺、碳酸氯铺、碳酸纳、四棚酸销等.融融氢俐和碾酸俐的GB/T 1 6631 -1 996 二无端合缓冲榕掖是最通用的搅脱剂。其他恍脱荆还有3-对强基两氨酸、甘氨

22、酸、硅酸盐、对氟酣等。阳离子分离时，最基本的是酸性挽脱剂，如盐酸、硝酸等以及盐酸和间苯工贼或硝酸和硝酸僻二元棍俞榕液洗脱剂。5.7.2 非抑制型一般选择用作流动相的洗脱剂除和柱填充剂有足够的亲和力、并能将试样的阴、阳离子洗脱外，应该是本身背景电导率较低的物质。不用抑制桩，挽脱剂通过色谱柱眉直接进入电导检测系统。脱。阴离子分离时，苯用酸盐和邻苯二甲酸盐的缓冲榕液(pH=4-7)是最常用的恍脱剂。拧橡酸盐是一种具较强挽脱能力的挽脱剂，阴离子的洗脱顺序和守;榷工甲酸盐相同。氢氧化御和酣盐的棍合碱性洗脱剂对弱酸阴离子能够得到有效的分离。对于多价阴离子，如磷酸罐，可用葡萄糖酸盐加入四棚酸销和H3B03的

23、较强锻冲能力的洗脱剂恍阳离子分离时，一般采用硝酸、盐酸等恍脱剂以及乙二艘硝酸盐搅脱剂。用具有选择性络合能力的挽脱液可以成功地分离很多阳离子，如乙二月安阳离子加酒石酸根或份提辑异丁酸根组成的洗脱荆都具有很好的分离效能。在离子也谱法中，常常是通过改变流动相来改变选择性，选择适当的恍脱剂是改静分离的有效方法。其次，挽脱剂的离子强度和pH值也是选择性和分离的有效因素。5.8 体积排除色谱法中用流动相体权排除色谱法句其他液相色谱法不同，不采用改变流动相的方法来改静分割皮.搅动相的选择才53要考虑其潜解试样的能力与柱填充剂的匹配以及在分离时的温度下是否具有低粘度，因为高粘度的流动相将限制扩散作用，降低分离

24、度。流动相必须与检测器匹配外，也必须带虑流动相与柱填咒剂的匹配，用强极性榕荆丙酬，乙畔，二甲基班枫和水作流动相时，通常不能用于聚苯乙烯桂填克剂。在使用软质凝胶时，必须在流功相中加入盐类以保持离子强度，防止离子型试样通过色谐柱时导致凝胶收缩及色谱柱的静避性降低。而使用硬质凝胶(如硅胶)时，含水的流动相巾的pH值必须保持在2-8.5之间，防止住填充剂降解。5.9 梯度流脱在分商品值范圃较宽的复翻的棍合组分采用梯度搅脱技术，对流动相的费求应该是糟剂强度随时间而显一定规律的变化，使得到的位谱图上的各个组分的谱带都有良好的分离。梯庶洗脱可以改善分离，缩姐组分洗脱的时间以及提高低含量组分检测的灵敏度。5.

25、10 溶剂的纯化用作流动相的榕荆在使用之前，应该除去液体中的固体杂质，必要时，还应该纯化，纯化时通常使用硅胶、氧化铝、有时亦使用燕馆。最好使用专门用于商效掖相色谱的纯榕剂。一般采用加热回流、越声搜报葫、通入氮或氯气或真空方法脱气，除去榕解在流动相中的空气、避免在分离过程中在泵、色谱柱、检测器里形成气泡，消除流动相中存在的痕量氧气对试样、流动相、性填充剂的氧化降解作用。6 柱填充剂高效色谱性是现代掖相(g谱系统的核心，他能提供分离的组分生最小的谱带加宽。因此，良好的柱填咒剂必须是能填克均匀，回定相传质阻力很小的物质。一般使用的柱填充剂应该是:一一固定相句流动相必须是互不相槽的F具有高比表面积的位

26、状物质或一定孔径的多孔物质g一一具有良好的机械性能。GB/T 16631 1996 6.1 液伽固色谱法中柱填充荆般采用具有较大比表面飘(50-100m2/g)的眼附剂，通常是硅胶、辄化铝略。有多孔型柱填充剂和薄壳型柱填充剂，前者有球形和无定型工种形状。目前大多数液回色谱法中使用的是5-10m范阔的多孔型球形磁肢柱填充剂.对酸敏感或者能起催化反应的试样，可以考虑使用辄化铝。吸附剂表田上吸附的水分子，在吸附分离性能中具有黛要作用，阳吸附剂水含麓的控制通常是依靠改变流动相中的水含撞来实现，一般用等水溶剂作流动相。使用等农溶剂有以下放处z一每次分离时，组分的保留值变化不大s在某些情况下可挟得较高的柱

27、效率和减少谱带的拖尾s部分补偿不同批号同类吸附剂之间的整别;一一在分离过程中，可减弱吸附剂对试样的不必要害的催化反应。其次，流动相中加入改性剂也能改善分离性能。液剧色谱和液唰械色谱怯中用柱填充剂和载体，见附录E(提肃的附录表El)。6.2 被w掖色谱法中柱填充荆般是在惰性载体上均匀地涂攒一层剧是液或者是用在玻璃珠实心核的表面沉积一层多孔活性涂居(一般用磁胶，也可有氧化铝)t形成表面多孔磨颗粒t(多孔愿厚度一般为1-3m)在此囊团多孔层上再涂愤一层固定液的薄亮型柱填充剂。由于机械涂愤的固定液容易流失，因此，目前在液唰掖色谱法中多数都使用化学键合相填充剂。6.2.1 化学键合相柱填充剂化学键合相填

28、充荆是为了克服机械涂愤固定概在液被包谱法中的不足而发展起来的，由于固定掖是经化学键合到载体上的，在使用过程中不易搅脱或者流失，所以，但谐柱性能相当稳定。化学键合相填充剂一般是在硅股骂是即上的磁醇基因与各种有机化合物或有机硅化合物反应，键合上各种特定的基因而成的。这些特定基因，除烧基外，还有好带巍、腊巍、硝巍、烧慕腊、工醇基等，形成具有不同极性的化学键命相填充剂。化学键合相填充剂有三种形式zSi-O-R(硅酸酣该填充剂容易水解，鹅稳定性盏，目前已较少使用。若使用硅酸酣填充剂时，只能用不含水和酵的流动相。Si-C和Si由N诙填咒剂的水解和热稳定性比硅酸醋填充剂性能好。但是，在填充剂表团常会留下一肆

29、无用的残藩，影响组分的保留特性或使色谱峰描赂。当使用水溶液作流动相时，必须将pH值限制在4._，8的祖国之内。Si-O-Si-R(硅氧惋该填充剂是通过礁醇基与单、二或三氯硅烧、二甲基、氨基、磁氧慕或烧氧基础惋反应而制得的单分子腥的键合相填充荆。这种填充剂在2-8.5的pH值范围内水解稳定性是很好的，热确定性也好，是目前质量最好、应用最广泛的化学键合相填充剂。如果键合的基团部分(R)含有官能朋，如带幕、十八惋基等，得到的就是非极性化学键命相。若含有官能团，如硝酸搓、氟菇、提基等，得到的就是极性化学锦合相。化学键合相填充荆比机械涂满固定诚的固定相有很多优越之处:一一不需使用预饱和柱p由于固定液永久

30、性地键合在载体上，所以，在恍脱过程中，固定液不易洗脱或流失，流出液不受固定液陌染，增加色谱柱的稳定性和薄命;具有很高的桂效率和在高压下有很好的机械性能s能够采用各种程序控制技术，包括梯度搅脱F一一由于可以键合到载体上的官能团的种类很多，因而，JE相和反相谐的分离都可以用最简单的GB/T 16631 1996 直接的方式完成。液相色谱法中使用的化学键合相柱填充剂，见附录F(提示的附最)。6.3 离子交换色谱法中柱填充剂离子交换色谱法中使用的柱填充剂应该是:一一陶子交换物质应该是不榕解的，一一具有化学稳定性p一有一定的离子交换容最p在一定压力下，离子交换填充荆结构应该是稳定的，理想的应该是均匀的球

31、状颗粒。般使用的离子交换柱填咒荆是用聚苯乙烯和工乙烯基苯共廉物基体，被离子型官能团所取代的产物的聚合多孔型填充剂。最常用的娃具硝酸基(-SOgH)的阳离子的和具三烧藕镣(-NRg)+的阴离子的普通的树脂那离子交换剂。薄壳细填充剂用玻璃微球或表丽多孔微粒(薄壳磁胶作提体，再涂横一层廉合的有机离子交换剂。化学键合相柱填充荆是以硅胶为捺体，然眉街上丽键合上一层撒合物，除聚苯乙烯外，还可用其他聚合物如磁酬、氟碳聚合物)t再可引入离子交换慕阻。由于磁股基体在pH值超过8.5时开始溶解，所以他们在强碱条件下不能应用。其次，也可以在多孔型或薄亮型硅股上除横液体离子交换剂。离子交换剂中由于不同的官能朋而表现出

32、不同的特性。因而，在选择离子交换剂时，不阔的廉合相和不间的取代基的离子交换剂(强、弱离子交换剂)可以使组分的分离颇序成分离选择性产生盖异。对于两性化合物(如氨燕酸、激白质等)，在一定的pH值下，可以用阳就阴离子交换剂分离.离子交换剂中离子交换容量很攘攘，组分的相对保留值和试样的负辙嚣随离子交换睿蠢的增加阳增大。离子交换色谱法中用柱填充剂，见附录E(掘浓的附最褒E2).6.4 离子对色谱法中柱填充剂离子对色谱法中大多采用微坡的(5-10m)多孔型柱填充剂。反相分离系统中，目前通常使用非极性化学键(合相柱填充剂。正相分离系镜中，一般使用多孔细磁胶作载体，以机械吸收并加有脱离子的缓冲水溶液作剧主运辙

33、。但是必须防止反离子从固定相中榄失以及水相必须有充分的缓冲作用。6.5 离子色谱法中校填咒荆离子色谱法中，一般用多孔型和薄亮型柱填充剂。抑制型。包谱性常用陶子交换容量低、而有很高分离效能的薄亮型离子交换剂。抑制柱填充离子交换容量高的中、高交联度的强酸型阳离子或强碱型阴离子交换剂，但是，填充抑制柱在抑制柱容量税一半时，往往会产生基绒变楚的现象，因此，在使用一定次数后必须再生。纤维抑制柱是通过离子交换纤维膜来进行抑制反应，但仍受榄脱剂强度和性质的限制，也不能用于梯度挽脱。新型的平板微膜抑制柱是同时具有填充抑制柱的离子交换容最高和纤雄抑制柱的能自动连续再生及保持动态平衡的优点，适用于梯皮洗脱。非抑制

34、型。色谱柱一般采用离子交换容量低的多孔型离子交换剂.6.6 体积排除色谱法中柱填充荆体积排除色谱法中使用的柱填咒剂按照化学樊型分为三类s软质、半硬质和硬质凝肢。软质凝肢。适合于用水溶液作为流动相，这种技术称凝胶过滤色谱法。由于色谱柱惨遭性小，只能在低流速下使用，其次承受压力也很小，因而也不能在高压下使用。一般分离水榕性的小分子戴的物质。半硬质凝胶。适合于用有机榕剂作为流动相，这种技术称凝脱惨避色谐法。由于能谐枝惨避性良好并具有较好的强度，所以，可在较高的压力下提高流速时使用.一般孔径范阁能避用于从小分子撒到分GB/T 16631 1996 子最跑过106的大分子的分离。硬质凝胶。可用水溶被或有

35、机梅刑作为流动相。由于色谱柱惨遭性很高，强度好，可以在较高服力下的高流速时使用。一般孔径范围遁用于分子量从104-106的大分子的分离。在体权排除色谱法中，由于柱填充剂的孔役的大小决定了试样分子量分离的拖围，因此，在选择柱填充剂时，理想的柱填充剂在分子量对保留值的校准曲钱回上，试样分子大小的保留值应该是在排除极限和惨遭极限之间的线性惨遭性范周之内。体积排除能谱除中用柱填充剂，见附录巴(提肃的附最表3)。7 试验前的准备工作7. 仪榴液相色谐仪安放的地点应该符合环境要求，见附最G(提乐的附最).与色谱柱及流路的连接应该严密，在试验设定的压力(高压或低压)条件下，不能漏液，流速稳定。仪器的灵敏度、

36、基钱漂移应该满足试膛的要求。7.2 色谱柱的填充方法填充色谱柱的最佳步骤才三摆取决于所用的柱填充剂的性质和颗粒大小粒径)。填充良好的也谱柱应该是没有精掏、裂痕和颗粒粒径分级的、均匀的填充床。柱填充荆婴尽可能的紧臂，但不能使颗粮破裂。7.2. 干法填充干法填充的方法与气相色谱法填充色谱柱基本相同.适用于粒径20m的柱填充剂的填蝶。般将柱管的一端用金属网，多孔烧锚片，多孔捕网堵住，在振动柱管或减压情况下载入柱填充剂，待填充均匀、紧哥哥以后，再将柱智的另一端堵住。7.2.2 匀浆填完使用的柱填充荆会在溶剂中榕胀或颗粒直径小于20m时，一般采用勾浆填充.一般选择适当的溶剂，将柱填咒剂颗粮分散在该溶剂中

37、，制成勾浆悬浮体，在加压下填装入柱管内。肘子大于10m颗粒粒径的柱填充剂，因沉降速度比较快，最好选择与颗啦癌度近似相等的溶剂配制悬浮体，这种方法称等密度勾蝶填览。在填充之前，柱填充剂应始终保持悬浮状态，不聚集结块，不沉降分级。在榕班中会榕胀的性填充剂，在填充之前，必须预先在填充时用的溶剂中榕胀。溶剂不应与性填充剂作用，填辑完毕后，榕剂应容易除去。7.3 色谱性的保养为使色谐柱保持柱效能，延长寿命，必须诠意以下事项z一一色谐柱应该避免震动、机械撞击相过高的温度，以防填充床产生裂纹g般情况下，应该避免反冲，以防填觉床的移功s一色谱柱奉?快期存放，应该用适当的溶剂宽满，并将两端封住，以防填充床干裂自

38、一一使用时，不跑过规定的压力、pH值和潜剂的限制。一一在进样器和色谱柱之间连接一根保护柱，不使其有害物质商E脸色谐柱。7.4 流量的测量在液相色谱法中，为准确测定保留值和住谱峰的大小，保持流量稳定及精确测撒流撒是非常就要的。尤其在体积排除色谱法中，流量的变化舍给分子量测定带来较大的误差。由于色谱性部分堵塞，流动相粘度的变化和翻度改变等因素都会使流量发生变化。最常用测量流量的方法是容量法。这种方法是在规定的时间内收集流动相体帜。在体积排除色谐法中，常用一个虹吸计数器自动测量流量。他是使流功相流到一个具有一定体积的虹吸管里，当虹吸管排空时就会启动一个光电开关并在记录的包谐图上打上一个记号。根据已知

39、虹吸管GB/T 16631一1996的体积和依据讯号之间的距离附推算出时间盾就能测撞出流量。这类流蠢的测量误撞在1%左右。此外，也可用重量法测量，即在已知的时间内将流动相收集后，称量。虽然此种方法测量流量最准确，但不能提供一个连续流量记录。一般只在校正泵的流最时使用。7.5 试样的准备根据有关来样标准规定的条件进行采样。试样必须是代表总体特性最值的少景物质。接触有梅和危险性试样时，应该符合安全要求，见附录H(提示的附最。试样的特赚保存和试验前需作特殊处理时，应该作必要的说明。液体试样选用容量合适的注射器、环管或自动进样器导入试样。固体试样通常榕解在适当的榕剂中，再按掖体试桦的进样方法与李入试样

40、。导入试样的最应在检测器响应值的钱性施围之内。7.6 衍生化在紫外一可见光旺没有吸收或不能激发荧光的组分，可以用衍生化试剂在柱前或柱脂进行衍生化反应，愤之生成具有紫外生色革团成荧光基因的衍生物，可以改善色谱分离，提高组分的检测响应。性前衍生化用手工或离线为武较易进行，组分衍生化以后，再进入色谱分离系统。因此，任何溶剂或烟台榕剂均可使用，对反应进行的方式没有限制，反应速率不受时间的影响，选择合适的试剂以及萃取方法可以悄除许多干扰，过量的试剂和榕剂容易除去。不足之处是可能发生的副反应，使色谱图复杂化。柱后衍生化是在线进行，色谱柱的流出物直接进行衍生化反应并与一台适当局的检测器相连。因此，对流动相的

41、选择严格，一般使用水榕性戒与水漉舍的榕剂，问时必须考虑衍生化试剂，反应产物的溶解度以及他们句流动相可能发生的制反应，衍生化试剂对检测器不能有响应，并且，衍生化反应必须在较嫂的时间内完成，一般是在加热保植的情况下进行。7. 7 试验的准备根据试验的要求，一般应选定下列参数z一一色谱性的材质、内径(mm)、*度(cm)，一柱填充荆名称及其粒径(m)或孔径或表面积p来用等度洗脱时，流动相名称及其组成、流速(mL/min);采用梯度洗脱时，流动相的名称、初始组成、组成变化事、最终组成等各种程序及流速(mL/min); 一一性精温度、进样器晦度，C;一-己最低的速度(cm/min)、衰减。8棉作按照试验

42、的要要求，选定各种参数，进行试验。在达到各项预定的数值(温度，流速等).仪器的基钱稳定之后，用进样提置辱入试样，并立即记最试样的辱入点。依据试样中组分含酷的多少，调节仪器的衰减比，使各个组分的色谱峰尽可能的全部记录下来，但不得超出记录器的最辘辘阁。亦可使用数据处珊装置。梯庶洗脱分离之后，应把梯度最脂部分的槽荆恍去，使色i普柱再生回复到切始状态。9 色谱栓的评价也一定的操作参数条件下，一根填充良好的色谱柱所能提供窄的谱带和改善分离的相对能力。这种柱效能，可根据色谱数据进行评价，一般用理论板数(川，有效板数(nef)，理论板高(H)，折合板高(h，)表刀t。GB/T 16631-1996 其次，两

43、个相邻组分的分离程度，可以用分离度(R)表册。10 钮谱固的整理根据色谱图可以得别各个细分的保留值、峰高、半高峰宽和峰丽积。峰高和峰丽积t且可以根据积分仪的记录和指示值来测量。并可以用数据处理装置处理色谱数据。典型的栋准也谱回应该明确地标明必要的操作参数，见附录J(提示的附最。11 定性分析在给定的色谱操作参数条件下，一个化合物的保留值是该组分的特性值。因此，最简单的方法是用标记物与米知组分的保留值直接比较。可以更换多种柱填充剂、流动相及其组成来实现保留值的比较。可以用流分收集器收集被分离出的纯组分，利用各种类型的官能团和细分的瑞择性显色反应来获得分离出未知组分的定性情息。可以用液相钮谱一质谐

44、联用仪，液相谱一红外光谱联用仪或用其他仪器和化学方法对未知组分进行鉴定，见附录K(提斌的附录)。12 l挺撒分析被相色谱法的定量分析结果的准确程度取决于所果用校准的测定方法和组分谱带分离的程度(最小的谱带重叠)。严格控制某一具体分析的色谱操作参数的能力决定着分析结果的精宿度。因此，从开始采样到最后计算的各个操作步辘都要十分细心，才能获得准确的定最分析铺果。按照色谱阁中各组分谐带的峰高戒峰阳积，测定各组分的壤之间的关系。各组分的最与响应值应该虽线性关系，谱带最好娃对称并且彼此完全分离。常用的定髓分析方法有:a) 内标法(见GB/T9088中7.12); b) 外栋法(见GB/T9088中7.13

45、)I c) 叠加法(见GB/T9088中7.14)。计算公式，见附录L(提乐的附录)。12.1 定量结果的表示方法定最分析的结果一般用质最分数和体积分数，其常用分数单位为10一2(%)、10(%0)、106(ppm) 或mg/L、g/m3等表示。12.2 精密度各组分分析结果的精密度由各分析方法中所规定的标准来确定。12.2.1 重复性。12.2.2 再现性。13 分子量的测定用体积排除色谱法测定高分子化合物的分子最及其分子最分布，它是以化学惰性的多孔物质作为朋定相，有机榕剂成绩冲榕商定及各种盐的水榕液作为流动相，试样的组分按分子体积(流体力学体职)的大小进行分离，利用校准曲线或函数和特性检测

46、器进行测定。13.1 色谱柱的校准体积排除色谱法不是一个绝对的测定方法，对给定的色谱柱需要用单分散商分子的分子参数(分子盘、特性帖度、流体力学体积挣)标定其淋洗体积与分子参数之间的关系，然后用数学函数或曲钱形式表刀飞。GB/T 1 6631 -1 996 13. ,. , 堪分布校准Mw 用难分布的标准物质标定色谱性是目前常采用的方法。它是使用M.值小于1.1的一系列分子最不同的标准物质，进行给定试验条件的色谱分析。从峰位、体积得到不同分子量的标准物质的淋洗体积(V.) 以淋挽体和与相应的分子量的对敬(lg)M作阁，绘制19M-V.的校樵曲线。然后，在相同的试脆条件下，将试样进行色谱分析，根据

47、试样中各组分的淋洗体积直接从校准刷线上查得分子量值。倪菇，比较理想的标准物质只限于用阴离子廉合方法得到的聚苯乙烯、聚氯乙烯、黯乙烯和骤异丁烯等。该方法用的试样与栋准物质的性质一致时，才能获得准确的分子量值。因此，方法的应用受到一定的限制。标准物质的分子量可用激光)光散射法、惨遭压法或粘度法测定。13.2 普通校准由于色谱栓的淋出体积真正反映的是试样的流体力学体积(Vh)，因而.1gM-V.的标定关系只能用于测定与标准物质相同的试样，因为不阿类型的试样特别是南分子物质，当分子最相问时，他们的流体力学体积并不相间。如果用不问类型的试样在相同的试验条件下进行也谱分析，用流体力学体职作为分子参数的投准

48、曲线就函数，也就是用特性柑度与分子量的乘帜的对数值(lg(7J)M)为纵坐标，淋恍体积为横坐标作图所得到的曲线，官就是一条时多数高分子物质都普遍适用的校准曲线。普适校准曲饿得到的数据是各淋搅体积所对应的(7J)M.所以如果要得到分子踵，还需用粘度计测定各淋洗体积的印。如果试样和标准物质在工作榕剂中的特性粘度分子捷方程式即M-H方程式(7J)=KM叮常数K、值已知时，见附录M(提示的附最就可以通过公式(2)把标准物质的19M-V.的校准曲线转换成试样的19M-V.的校准曲钱而直接应用。19Mz且Llg(争十(旦土1)lgM1.( 2 ) K2的+1式中:Ml一一标准物质的分子量$Mz一一试样的分

49、子撒FI.K)一一标准物质在某榕荆中的粘度常数p2.K2-试样在某榕剂中的粘膜常数。目前，常用的标准物质是用陶子型聚合的聚苯乙烯(分子最6X 102-3X 106)、葡骤糖、骤环氧乙烧。普适校准是目前测定分子囊中使用最广泛的方法。13.2 色谱圆的整理典型的体积排除法色谱圆，见附录N(提示的附录)。按色谱峰的前情和盾情画一摹钱，再将整个谐图句基钱所围的面积按淋搅体积等分为若干条块(至少20条块以上).测量这些淋洗体积处的条块高度，并由校准酣绒3挂出备等分点的淋恍体积所对应的分子量值。条块高度的测雕误盘一般应该小于士0.1mm. 13.3 分子麓的计算根据淋榄体积和分子最值，把般据列成衰，见附录P(提浓的附最).计算试样分子最平均值。数均分子最(MD).:t均分子量(M.，)和多分