GB T 19567.2-2004 苏云金芽胞杆菌悬浮剂.pdf

1、GB/T 19567.2一2004Bacillus thuringgiensis suspension concentrate 2004-12-01实施 共金云2004-06-22发布M 刃、ICS 65. 100. 10 G 25 发布中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会GB/T 19567.2一2004前言苏云金芽胞忏茵(Bacillusthuringiensis .B. t. )是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴胞晶体中的毒素蛋白，其中，本标准所检测的对鳞翅目害虫有毒力的毒素蛋白的相对分子最为130kDa.生物测定中甜菜夜娥用于检测对鳞翅臼

2、贪夜峨属害虫有特性的苏云金芽胞杆菌悬浮剂的毒力，小菜娥和棉铃虫用于检测对其他鳞翅目害虫有活性的苏云金芽胞杆菌悬浮剂的毒力.本标准是根据我国以往制定的苏云金芽胞杆菌行业和企业标准等有关材料，结合我国的实际情况制定的。本标准对苏云金芽胞杆菌悬浮剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金芽胞杆菌生产提供了统一的技术依据.本标准的附录A是资料性附录，附录B是规范性附录.本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准起草单位t农业部农药检定所、华中农业大学微生物农药国家工程研究中心、湖北省生物农药工程研究中心.本标准主要起草人2姜辉、喻子牛、陈守文、王开梅、王晓军、吴新平、顾宝根

3、.本标准由农业部农药检定所负责解释.I E GB/T 19567.2-2004 苏云金芽胞杆浮剂1 范困本标准规定了苏云金芽胞杆菌悬浮剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运.本标准运用于由用于防治鳞翅目害虫的苏云金芽胞杆菌原粉和助剂制成的苏云金芽胞杆菌悬浮剂。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的是新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.GB/T 1250 极限数值的表示方法和判定方法GB/T 160

4、0-2001 农药水分测定方法GB/T 1601 农药pH值的测定方法GB/T 1604 商品农药验收规则GB/T 1605-2001 商品农药采样方法GB 3796 农药包装通则GB/T 16150-1995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法GB/T 5451-2001 农药可湿性粉剂润湿性测定方法3 要求3. 1 外观z棕黄色或揭色悬浮液体.3.2 苏云金芽胞杆菌悬浮剂应符合表1要求.表1苏云金芽胞杆菌悬浮剂控制项目指标项目霉素蛋白(130kDa)(%) 二注毒力效价(P.r.H.a. )(OU!L)，(S.e. )!(IU(mg) pH值悬浮率(有效成分)(%)二主细度(150m)(%)

5、二主指标O. 6 6000 4.5-6.5 80 98 注IP. x.、H.a.和S.e.分别为小菜峨(Plutellaxylostell川、棉铃虫(Heliothisarmigera)和甜莱夜峨(Spodoptera exigua)缩写.4 试验方法除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液.4. 1 抽样按照GB/T1605一2001中液体制剂采样进行，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量不少于250mL. 1 GB/T 19567.2-2004 4.2 毒素蛋白含量用十二炕基硫酸纳-聚丙烯散胶(SOS-PAGE)凝胶图像处理法进行测定.4.2. 1 方法键要用碱性溶液

6、处理苏云金芽胞杆菌悬浮剂伴胞晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SOS-PAGE.依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，用电泳图像扫描蛋白区带面积，进行定量.4.2.2 仪器、设备a) 电泳仪，b) 双垂直式电泳槽(1.5mm凹形带槽橡胶模框).凝胶板丽积170mmX 170 mm(1. 5 mm、20孔样品糟模具)I 。电泳凝胶成像系统gd) 离心机:10 000 r/min; e) 分析天平z精确至0.0001 g. 4.2.3 试剂和l3渡4.2.3.1 过硫股钱(APS).4.2.3.2 十二烧基硫酸纳(SOS) 4.2.3.3 四甲基乙二胶TEMED)。4.2.3.4

7、 氢氧化锅. 4.2.3.5 30%丙烯酌胶凝胶母液s称取丙烯肮胶30g.亚甲基双丙烯酌胶(原称s甲叉双丙烯耽胶0.8 g.溶于100mL蒸馆水中，过滤，于4C暗处贮存备用.4.2.3.6 分离胶缓冲液z称取三短基甲基氨基甲烧(Tris)18. 17 g和SOSO. 4 g溶于蒸惚水中，用浓盐酸调至pH8.8.用蒸馆水定容至100mL. 4.2.3.7 浓缩胶缓冲液z称取Tris6. 06 g和SOSO. 4 g溶于蒸馈水中，用浓盐酸调至pH6.8.用蒸俯水定容至100mL. 4. 2. 3. 8 电极缓冲液E称取Tris3.036 g.甘氨酸14.42g.SOS 1 g .用水溶解并定容至1

8、000mL. 4.2.3.9 3 X样品稀ff.液:1 mol/L、pH6.8Tris-HCl 18.75 mL. SOS 6 g.甘泊30mL.就基乙院15 mL.少许澳盼蓝，用蒸馆水定容至100mL. 4. 2. 3. 10 固定液=量取95%乙醇500mL.冰乙酸160mL.用蒸馈水定容至1000mL. 4. 2. 3. 11 染色液s称取考马斯亮蓝(CBB)R-2501 g.加入95%乙醉250mL.冰乙酸80mL.蒸馆水定容至1000 mL.溶解过滤后使用.4.2. 3. 12 脱色液s量取95%乙醇250mL.冰乙酸80mL.用蒸馆水定容至1000 mL. 4.2. 3. 13 毒

9、素蛋白标样z毒素蛋白(相对分子量为130kOa)含量为8.0%的原粉.4.2.4 样晶处理将试样摇匀后取100L加入一1.5 mL离心管，加入0.5mol/L氢氧化纳溶液25L(使氢氧化纳溶液的终浓度为0.1mol/L) .放置5min;称取标样20.0mg(准确到O.1 mg) .移至1.5 mL离心管中，加1mL水充分悬浮，取100L加入另一1.5 mL离心管，加入0.5mol/L氢氧化纳溶液25L(使氢氧化销洛液的终浓度为0.1mol/L) .放置约5mino分别向上述标样和试样中加入3X样品稀释液75L.使最终体积为200L.于100C沸水中煮沸6min，离心(2000 r/min)

10、10 min后取上层消液，以备电泳上样.4. 2. 5 SDS-PAGE分离毒素蛋白4. 2. 5. 1 制备7.5%聚丙烯酷肢凝胶采用不连续缓冲系统，制胶方法见附录A(资料性附录入4.2.5.2 上样取上述标样溶解液上层清液，于聚丙烯Ilit胶凝胶的上样孔中分别上样6、8、10、12、14L(毒素蛋白2 a GB/T 19567.2-2004 含量约为3g-7g)，作为标准曲线，再取一定体积的试祥浓浓上层消液毒素蛋白含量约为5g)，加入到上样孔中，注入电极缓冲液后，接通电源.4.2.5.3 电泳电泳初期电压控制在100V左右，待试样进入分离胶后，加大电压到170V，继续电泳，当指示剂前沿到达

11、距底端1cm左右时停止电泳.取出胶板，在7.5%(体积分数乙酸中注泡30min. 4.2.5.4 染色将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜.4.2.5.5 脱色倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加人脱色液，于37C恒温脱色，更换几次脱色液，至背景清晰为止.4.2.6 测定胶板经脱色后，可清晰地看到分子量为130kDa蛋白区带，用凝胶成像系统对凝胶进行分析.样品中毒素蛋白的百分含量(x)按式(1)进行计算.式中sx= ，XnX100% C M一一由标准蛋白回归曲线计算得到的蛋白量，C一一样品的浓度pV一一样品的加样体积gn一一样品的稀释倍数.4.2.7 允许差取其算

12、术平均值为测定结果.两次平行测定结果相对偏差小于等于5%.4.3 毒力效价的测定按附录B(规范性附录进行.4.4 pH值的测定按GB/T1601测定.4.5 细度的划定按GB/T16150-1995中2.2进行测定.4.6 悬浮率测定4.6. 1 仪器、试剂a) 量筒，250mL，具塞，b) 吸液管，c) 秒表gd) 三角瓶，500mL, 100 mL, e) 恒温水浴锅，f) 标准硬水:配制方法按GB/T5451-2001中标准硬水配制方法进行.4.6.2 操作步骤. ( 1 ) 将样品招匀后取5.mL(精确到u0.01 mL)，于100mL三角瓶中，加入标准硬水100mL.用手左右振荡50

13、次.制得的悬浮液移到250mL具塞量筒中，用标准硬水稀释到250mL。将量筒放人30C士1C恒温水浴锅中，当悬浮液温度达到30C时，将量简盖好，拿起量筒先轻轻摇起沉淀物，然后有规律的以最筒中部为中心上下颠倒305，使呈均匀的悬浮液，最简仍放入恒温水浴中，打开盖子，育事置30min，用吸液管以拍气法将量筒上部9/10的悬浮液抽出(在155-30 5内完成。抽液过程中，吸液管应依附筒壁随液面下降而下降，勿搅动下部沉淀.该供试悬浮剂及量筒内剩下的GB/T 19567.2-2004 25 mL悬浮液，按附录B(规范性附录进行毒力效价的测定.4.6.3计算样品中的悬浮率(Y)按式(2)进行计算g11 1

14、. 1X(C-Q) Y=c 100% 式中sc一一供试悬浮剂的毒力效价，Q一一留在量筒底部的25mL悬浮液的毒力效价。4.6.4 允许差两次重复测定结果之差应不超过10%05 检验规则符合GB/T1604有关规定.极限值按GB/T1250处理.6 标志、标签、包装、贮运6. 1 产品包装应符合GB3796规定，同时注明所用标准编号及检测所用试虫.6.2 悬浮剂主要采用塑料瓶包装，密封，6.3 贮存时严防日晒，勿受压，置于阴凉干燥处.6.4 运输时，注意轻放，防止损坏.( 2 ) 6.5 保证期z在正常贮运条件下，苏云金芽胞杆菌悬浮剂质量保证期从生产日期算起为十八个月，产品出厂时毒力效价和毒素蛋

15、白的含量不低于3.2指标，保质期内产品毒力效价和毒素蛋白的含量不低于3.2指标的60%04 A. 1帘j板附录A(资料性附录)电泳提胶的制备GB/T 19567.2-2004 本实验选用双垂直电泳槽，具体操作根据实验室条件而定。基本操作是根据电泳槽高矮大小，选择两块大小一样的玻璃板，其中一块端部带有2cm-3 cm高的凹槽.两块玻璃板洗净干燥后，在无凹槽的破璃板两边各放一条间隙条(塑料条、胶条都可以，其宽度、厚度根据需要而定).然后放上带凹梢的玻璃板，用夹子将两块玻璃板固定，这样两块玻稍板之间就形成了一定的问隙。形成的间隙下端应该封闭，以防灌入的胶液漏出.一般用胶纸条封闭，待浪人的胶凝固后，再

16、撕去胶纸，或用1%-，5%浓度的琼脂封闭，方法是z在琼脂中加入电极缓冲;在或蒸恼水，在沸水浴中加热溶解，将带有间隙的玻璃板装置垂直放在一个高3cm、宽3cm、比玻璃板宽而长的一个小稽内(商品电泳槽有配套装置).趁热将溶解的琼脂胶灌入小槽内，待冷却后取出，玻璃板装置下端即封严，可进行灌注聚丙烯股股胶液.A.2 制备分离胶从冰箱中取出帘l胶试剂，平衡至室温.按表A.1配方配制分离胶。本试验巾分离胶浓度为7.5%.按表人l配方将胶液配好、混匀后，迅速注人两块玻璃的间隙中，至胶液商离玻璃板凹槽3cm左右.然后在胶面上轻轻铺1cm高的蒸恼水，加蒸惚水时通常il攻鸦板慢慢加入，勿扰乱胶面.垂直放置胶板于室

17、温.1h左右使之凝聚。此时在凝胶和蒸馆水之间可以看到很清晰的一条界面。然后倒掉胶面上的蒸倒水.A.3 制备浓缩胶用量根据实际情况而定，如l备方法按表A.1配方配制.按表A.1配方将胶液混合，取少量灌入被璃极|可隙中，冲洗分离凝胶面，而后倒出.将余下的胶液.注入玻璃板间隙间，使胶液液丽与玻璃板凹槽处平齐，而i后插入梳子(样品精模板).在室温放置20 min、-30min.浓缩胶即可凝聚。凝固后，慢慢取出梳子，取时应防止把胶孔弄破，取出梳子后在形成的胶孔中加入蒸馆水，冲洗未凝聚的丙烯酌胶等，倒出孔中蒸馆水，再加入电极缓冲液.将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳梢上，带凹梢的玻璃板与电泳梢紧贴在一起，形成

18、一个贮液槽，向其中加入电极缓冲液，使其与胶孔中的缓冲液相按触。在电泳摘下端的贮浪梢中也加入电极缓冲液.表A.1 SDS-PAGE凝胶的配方5 GB/T 19567.2-2004 附豪B规范性附录毒力效价的测定B.l 毒力效价的测定方法-一用小菜峨(Plutellaxylostella)作试虫的测定方法B. 1. 1 试剂或材料标准品.C5-1995.H，.b.20000 IU/mg. 小菜戴幼虫:P lutella xylostella 食用菜籽泊.酵母粉s工业用.维生素Cs医用，分析纯。琼脂g凝胶强度大于300g/cm. 磷酸氢二钊g分析纯.磷酸二氢梆z分析纯.聚山梨酣-80，粘度3.5Xl

19、O-m/s - 5.5X lO- m/s. 菜叶粉s甘蓝型油菜叶.80C烘干，磨碎，过80日筛.m;糖=分析纯.纤维素粉CF-ll.氢氧化仰g分析纯.氯化纳2分析纯.15%尼泊金z对经基苯甲酸甲黯(化学纯)溶于95%酒精.10%甲隆溶液z甲隆(分析纯榕于蒸馆水.干酷素榕液2干酶素(BR生物试剂)2g.加0.001mol/L氢氧化饵2mL.8 mL蒸馆水，灭菌.磷酸缓冲液z氯化制8.5g.磷酸氢二饵6.0g.磷酸二氢饵3.0g.聚山梨醋80溶液O.1 mL.蒸惚水1 000 mL. B. 1. 2仪器、设备磨口三角瓶，250mL.具塞.分析天平g精确到0.1mg. 电动搅拌器2元级调速.100r

20、/min-6 000 r/min. 医用手术刀.微波炉或电炉.振荡器.水浴锅.养虫管，9cmX2. 5 cm. 小烧杯，50 mL. 大烧杯，500mL. 试管，18mmX180 mm. 玻璃珠=直径5mm 移液管，10 mL.5 mL.2 mL.l mL. B. 1.3 测定步骤B.l.3.1 感捺液的配制6 GB/T 19567.2-2004 B. 1. 3. 1. 1 标准晶用分析天平准确称取标准品100.0mg-150. 0 mg(精确到O.1 mg)，放人250mL装有10粒玻璃珠的磨口三角瓶中.加入100mL磷酸缓冲液，疫泡10min，在振荡器上振荡3min，得到浓度为1 mg!

21、mL的标准品母液(该母液在4C冰箱中可存放10天然后将标准品母液稀释成浓度为1.000、0.500、O.250、0.125、0.0625、0.0313 mg! mL六个稀释感染液。B. 1. 3. 1. 2 悬浮剂样品将样品振荡20min，充分摇匀。用移液管吸取样品10.00mL(精确到0.01mL)，力11人装有90mL 元商蒸饱水的磨口三角瓶中，吸洗三次，充分摇匀得到100L/mL的母液。将母液稀将成含量分别为4.000、2.000、1.000、0.500、0.250和O.125L/ mL六个梯度稀释液.对有些效价过高或过低的样品，在测定前窃先以3个距离相差较大的浓度做预备试验，估计致死中

22、浓度(LC50值)的范围，据此设计稀ff浓度。B. 1. 3. 2 感染饲料的配制饲料配方g维生素C0.5 g，于自吕京溶液10mL.菜叶粉3.0 g .!i母粉1.5 g，纤维素t)1.0g，琼脂粉2.0 g，N，糖6.0g，菜籽汹0.2mL，10%甲M溶液0.5mL，15%尼泊金1.0 mL，蒸俯水100mL。将煎糖、陈母粉、干酌索溶液、琼脂粉加人90mL的蒸f留水中调匀。搅拌煮沸，使:a;fi完全溶化，JJn 人尼泊金搅匀.将其他成分用剩余的10mL蒸倒水调成糊状。Ei琼脂冷却至75CC左右时与之充分混合，搅匀，宣55C水浴锅中保温备用。取50mL烧杯7只，写好标签，置55C水浴中预热，

23、分别向每个烧杯中加入1mL对应浓度的感染液，以缓冲液作空白对照。向每个烧杯中加入9mL溶化的感染饲料，用电动搅拌器搅拌20s，使每个烧杯中的感染液与饲料充分混匀。将烧杯静置，待冷却凝固后，用医用手术刀将感染饲料切成1cmX 1 cm的饲料块.每个浓度取4个饲料块分别放人4支养虫管中，每管放入一块，写好标签.B. 1. 3. 3 接虫感染随机取已放置饲料的养虫管。每l1投入10头小菜峨兰龄初幼虫，每浓度4管，塞上棉塞，写好标签，在相同饲养条件下饲养。B. 1. 4 结果检查及计算感染48h后检查试虫的死亡tl况.判断死虫的标准是以细签轻轻触动虫体，元任何反应者判为死亡.计算标准品和样品各浓度的供

24、试昆虫死亡率，查Abbott表或计算校正死亡率(X，)。空白对照死亡率10%以下需要校正，大于10%则试验结果无效。校正死亡率按式(B.1)计算2式中gT一一药剂处理死亡率gc一一空白对照死亡率.T-C XB=7-可x100% ( B.1 ) 将感染液各浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡几率值，用f小二乘法分别求出标准品LC50值和待测样品LC;o值，计算待测样品的毒力效价(X2)。毒力效价按式(B.2)计算s式中gs一一标准品LC值pP一一标准品效价，v SXP 4、，=-, y .( B.2 ) 7 GB/T 19567.2-2004 Y 样品LC值.B. 1. 5 允许差毒力测定法允

25、许相对偏差，但每个样品3次重复测定结果最大相对偏差不得超过20%.毒力测定制剂各浓度所引起的死亡率应在10%-90%之间，在50%死亡率上下至少各有两个浓度.B.2 毒力效价测定方法一一以棉铃虫(Heliothisarmigera)作试虫的测定方法B.2. 1 试剂和材料标准品:C&1995.H，.，20000 IU/mg. 棉铃虫幼虫:HeLiothis armigera 黄豆粉z黄豆炒熟后磨碎过60目筛.大麦粉2过60目筛。院母粉g工业用.36%乙酸溶液g乙酸(化学纯).溶于蒸馆水.苯甲酸纳2分析纯.甲应s分析纯.维生素C:医用，分析纯.琼脂粉g凝胶强度大于300g/cm. 磷酸缓冲液2同

26、B.1.1.B.2.2 仪器、设备分析天平g精确到0.1mg. 电动搅拌器s无级调速.100r/min-6 000 r/min. 微波炉或电炉.振荡器.水浴锅.组织培养盘:24孔。搪瓷盘:30cmX20 cm. 磨口三角瓶:250mL.具塞。大烧杯:1000 mL。小烧杯:50mL. 试管:18 mmX 180 mm. 玻璃珠2直径5mm 注射器:50mL. 标本缸.恒温培养箱.B.2.3 测定步骤B. 2. 3. 1 饲料准备饲料配方g酵母粉12g.黄豆粉24g.维生素C1. 5 g.苯甲酸纳0.42g.36%乙酸3.9mL.蒸馈水300 mL. 将黄豆粉、M母粉、维生素C、苯甲酸销和36%

27、乙酸放人大烧杯内，加100mL蒸饱水湿润备用.将余下200mL蒸馆水加入琼脂粉内，在微波炉上加热至沸腾，使琼脂完全溶化，取出冷却至70C.与其他成分混合，在电动搅拌器内高速搅拌1min，迅速移至60C水浴锅中加盖保温.B.2.3.2 感染渡的配制将悬浮剂样品充分振荡均匀后，吸取1.00 mL(精确到0.01mL).至盛有玻璃珠的磨口具塞三角瓶8 、GB/T 19567.2-2004 中，加磷酸缓冲液99.0 mL.浸泡10min，在振荡器上震荡1min，即成母液.于分析天平上称取150. 0 mg-300. 0 mg标准品精确到O.1 mg).如上法制成母液.将样品和标准品母液用磷酸缓冲液以一

28、定的倍数等比稀释，每个样品和标准品至少各稀释5个浓度，并设缓冲液作对照，每一浓度感染液吸取3mL至50mL小烧杯内待用.对照吸取3mL磷酸缓冲液.B. 2. 3. 3 饲料和感挠渡的混合及分装用注射器吸取27mL饲料，注入上述己有样品或标准品感染液的烧杯内，以电动搅拌器高速搅拌0.5 min，迅速倒入组织培养盘上各小孔中(倒入量不要求一致，以铺满孔底为准儿凝固待用.B. 2. 3. 4 接虫感捺于26(:-30(:室温下，将未经取食的初孵幼虫(孵化后12h内)抖人直径20cm的标本缸中，静待数分钟.选取爬上缸口的健康幼虫作供试虫，用毛笔轻轻地将它们移人已有感染饲料的组织盘的小孔内，每孔一头虫.

29、每个浓度和空白对照皆放48头虫，用塑料薄片盖住，然后将组织培养盘逐个叠起，用橡皮筋捆紧，竖立放于30(:恒温培养箱内培养72h. B.2.4 结果位查和统计分析用肉眼或放大镜检查死、活虫数.以细签触动虫体，完全无反应的为死虫，计算死亡率。如对照有死亡，可查Abbott校正值表或按式(B.1)计算校正死亡率.对照死亡率在6%以下不用校正.6%-15%之间需校正，大于15%贝u试验无效.将浓度换算成对数缸，死亡率或校正死亡率换算成几率值，用最小二乘法分别求出标准品和样品的LC50值，按式。.2)计算毒力效价。B.2.5 允许差毒力测定方法的允许相对偏差要求与B.1. 5相同.B.3 毒力效价测定方

30、法一一以甜莱夜峨(Spodopteraexigua)作试虫的测定方法B. 3. 1 材料和试剂标准品，CS-2002.H，.b.20000 IU/mg. 甜莱夜戴幼虫，Spodo户teraezigua. 黄豆粉g黄豆炒熟后磨碎过60日筛.酵母粉(200日)，工业用.维生素C，医用.分析纯.15%尼泊金g对经基苯甲酸甲酣(化学纯溶于95%酒梢。10%甲!W，甲!W(分析纯)溶于蒸馆水.琼脂z凝胶强度大于300g/cm. 蒸馆水.B.3.2 仪翻分析天平z精确度0.1mg. 电动搅拌器s无级调速.100r/min-6 000 r/min. 微波炉或电炉.振荡器.水浴锅.组织培养盘224孔.搪瓷盘，

31、30cmX20 cm. 磨口三角瓶，250mL.具塞。大烧杯，1000 mL. 小烧杯，50mL. 试管;18 mmX 180 mm. 9 G/T 19567.2-2004 玻璃珠2直径5mmo 注射器，50mL。标本缸。恒温培养箱。B. 3. 3 测定步骤. 3. 3. 1 饲料配方黄豆粉32g( 60日).酵母粉16g(200日).琼!6 g，维生素C2 g，15%尼泊金6.7mL，10%甲隆4 mL，水400mL. 将黄豆粉、M母粉、维生素C、尼泊金和10%甲隆放人大烧杯中，加入150mL水，浪匀备用.将余下的250mL水加入琼脂，在微波炉上加热至沸腾，使琼脂完全溶化，取出冷却至70C.

32、与其他成分混合，在电动搅拌器内高速搅拌1mn，迅速移至60C水m锅中加益保温。. 3. 3. 2 感染液的配制称取CS，.b-2002标准品150.0mg-300. 0 mg(精确到O.1 mg)，至盛有玻璃珠的磨口具塞三角瓶中，加入100mL磷酸缓冲液，浸泡10min，在振荡器上振荡1min后即成标准品母液。将悬浮剂样品充分振荡均匀后，吸取1.00 mL(精确到0.01m口，至盛有被璃珠的磨口具塞三角瓶中，加磷酸缓冲液99.00 mL，疫泡10min，在振荡器上振荡1min, p成样品母液.以两倍稀释法将母液稀释成一定浓度梯度，每个样品至少各稀释5个浓度梯度，每一个浓度感染液吸取3mL至50

33、mL小烧杯内待用.对!l!吸取3mL磷酸缓冲液。B.3.3.3 饲料和感染液的混合及分装用注射器吸取27mL饲料，注入上述已有样品或标准品感染液的烧杯内，以电动搅拌器搅拌0.5 min，迅速倒入组织培养盘上各小孔中(倒人量不要求一致，以铺满孔底为准儿凝固待用. 3. 3. 4 接虫感染于26C-30C室温下，将未经取食的初孵幼虫(孵化后12h内)抖入直径30cm的标本缸中，静待数分钟选取爬上缸口的健康幼虫作供试虫，用毛笔轻轻地将它们移入已有感染饲料的组织盘的小孔内，每孔一头虫.每个浓度和空白对照皆放48头虫，用塑料薄片盖住，然后将组织培养盘逐个叠起，用橡皮筋搁紧，竖放于25C培养箱内培养72h

34、. .3.4 结果检查和统计分析用肉眼或放大锐检查死、活虫数，以细签触动虫体，完全无反应的为死虫，计算死亡率。如对照有死亡，可查Abbott校正值表或按式B.1)计算校正死亡率.对照死亡率在6%以下不用校正，6%-15%之间需校正，大于15%则试验无效。将浓度换算成对数值，死亡率或校正死亡率换算成几率值，用最小二乘法或有统计功能的计算器，分别求出标准品和样品的LCso，按式(B.2)计算毒力效价. 3. 5 允许差毒力测定方法的允许相对偏差要求与B.J. 5相同。.4 对掺入其他有效成分的可疑样品的检测对于某些符合正文3.2分析指标的可疑样品，可通过测定悬浮剂中胞品混合物的毒力贡献率，判定样品

35、是否掺入其他有效成分。. 4. 1 悬浮剂中不同成分的分离用丙阁将悬浮剂稀释成10mg/ mL的溶液.4c下5000 r/min离心10min，保留沉淀组分，用等体积的丙丽悬浮，再进行离心，共离心洗涤3次，保留沉淀组分g用等体积的蒸馆水悬泞沉淀组分，离心并保留沉淀m分，共离心洗涤3次，保臼沉淀组分，该沉淀组分即为悬浮剂中的胞晶混合物。. 4. 2 毒力效价的测定按B.1、B.2或B.3的方法，对悬浮剂及悬浮剂的沉淀组分(胞品混合物分别进行毒力效价测定。10 GB/T 19567.2-2004 B. 4. 3 样品中是否掺入其他有效成分的判断依据悬浮剂中胞品混合物的毒力贡献率(几)来判断样品中是

36、否掺入其他有效成分z毒力贡献率按式B.3)计算2X, =手Xl式中sX，一一悬浮剂样品中胞品混合物的毒力贡献率，I 单位体积悬浮剂中胞品混合物的毒力效价，T一一单位体积悬浮剂的毒力效价.幸?样品中胞品混合物的毒力贡献率小于20%，则判定此悬浮剂样品不符合标准.( B.3 ) . GB/T 19567. 中华人民共和国国家标准苏云金芽胞杆菌悬浮剂GB;T 19567. 22004 ，晤中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045网址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X12301;16 印张l字数22千字2004年11月第一版2004年11月第一次印刷晤如有印装差错由本社发行中心调换