GB T 28976-2012 草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法.pdf

1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民主t./、道昌和国国家标准GB/T 28976一2012草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法Detection and identification of strawberry latent ringspot virus 2012-12-31发布2013-06-01实施丹:牛气m飞-、.9 、问问/中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 28976-2012 目。昌本标准按照GB/T1. 12009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出入

2、境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人z杨翠云、于翠、闻伟刚、郑建中、印丽萍、李彬。I GB/T 28976-2012 草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了草莓潜隐环斑病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于植物材料，包括元性繁殖材料、种子和苗木中草莓潜隐环斑病毒的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法SNjT 2122 进出境植物及植物产

3、品检疫抽样3 草莓潜隐环斑病毒基本信息中文名:草莓潜隐环斑病毒学名:strawberry latent ringspot virus 缩写:SLRSV分类地位:Secoviridae科，温州蜜柑矮缩病毒属(Sadwavirus)草莓潜隐环斑病毒的其他信息参见附录A。4 方法原理病毒粒子的形态特征、为害症状、血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据，采用DA5-ELISA、RT-PCR、实时荧光RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行检疫鉴定。5 仪器设备、设施、用具和试剂5. 1 仪器设备酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平(感量o.001 g)、电泳仪、

4、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、超低温冰箱(-80 OC)、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器。5.2 设施植物隔离检疫圃。5.3 用具可调式微量移液器(2L、10L、100L、200L、1000L)及相应的元RNase吸头、元RNase离心管、PCR管、研钵、样品袋、标签、慑子、放大镜等。5.4 试剂5.4. 1 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。1 GB/T 28976-2012 5.4.2 SLRSV抗体、Trizol、焦碳酸二乙醋(DEPC)、液氮、三氯甲皖、异戊醇、异丙醇、乙醇，-琉基乙醇、AMV反转录酶、TaqDNA聚合酶、DNA

5、相对分子质量标记、澳化乙链、琼脂糖、澳酣蓝等。血清学和分子生物学检测试剂配制见附录B。6 症状观察及抽样6. 1 症状观察现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状，SLRSV为害症状描述参见附录A。6.2 抽样发现有病毒为害症状的植物材料直接送检;未发现症状的二期提，S_N/T2122中规定进行抽样，并送实验室检疫鉴定。/夕- -，之飞否/带草莓潜隐环斑病毒，应经过两种或树种以上的检、i方法并且互验证。具体操作流程可参照图/IoF 户飞. 病毒寄主组物/样品 / / 检测结果阳性圄1SLRSV鉴定流程图2 GBjT 28976-2012 7.2 双抗体酶联免疫吸附方法CDAS-ELlSA)

6、对种苗、球茎或由种子催生长出的叶片研磨，并按质量和抽提缓冲液1: 10的比例稀释，制备的汁液分别盛装于离心管中，离心后吸取上清液作为待测样品，并设阳性对照、阴性对照和空白对照。具体操作步骤见附录c7.3 RT-PCR方法植株叶片、种球或种子液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA。具体操作步骤见附录Do7.4 实时荧光RT-PCR方法植株叶片、种球或种子液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA。具体操作步骤参见附录E。7.5 鉴别寄主测定方法在栽种于植物隔离检疫圃中的鉴别寄主植物真叶长出后用于摩擦接种，对DA5-ELISA或RT-PCR检测SLRSV呈阳性的样品加入适量接种缓冲液研磨后接种鉴别

7、寄主。当任意一种鉴别寄主植物出现如下描述症状时，即可判定接种成功。对接种后表现隐症的鉴别寄主植物，还需要对接种叶片结合DA5-ELISA或RT-PCR方法验证，如果结果阳性则判定样品携带SLRSVoa) 克色黎CChenodiumamaranticolor)或昆诺黎CChenopdiumquinoa):接种叶7d内局部褪绿或坏死斑，以后是系统褪绿或变形，有时出现坏死或轻微的褪绿斑;b) 菜豆CPhaseolusvulgaris) :接种叶出现局部褪绿或坏死斑;c) 黄瓜CCucumissativus) :系统感染黄瓜，引起脉间褪绿和坏死，有时元症状;d) 黄花烟CNicotianarustic

8、a)或矮牵牛CPetuniahybrida):属系统性侵染且无症状出现。7.6 免瘟电镜方法利用草莓潜隐环斑病毒抗血清富集植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征，具体操作步骤按照SN/T1840规定进行。如观察到直径为30nm的球状病毒粒子，即可判定免疫电镜结果阳性。8 结果判定8. 1 样品经DA5-ELISA或者RT-PCR检测结果为阴性，判定该样品不携带草莓潜隐环斑病毒。8.2 样品经DA5-ELISA检测为阳性，如果RT-PCR结果阳性，且序列测定结果证实与所检测的草莓潜隐环斑病毒一致;或者经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，可判定样品携带草莓潜隐环斑病毒。8.3

9、样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阳性，经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄主植物出现相应的症状时，可判定样品携带草莓潜隐环斑病毒。9 样晶保存与记录结果9. 1 样品保存z经检测确定携带草莓潜隐环斑病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥室温环境中;种苗、鳞球茎等样品保存在一800C冰箱中，做好登记和标记工作。样品保存期限至少1年。3 GB/T 28976-2012 9.2 记录包括:样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片，免疫电镜检测需要有电镜图片

10、，RT-PCR检测应有电泳图及序列测定分析结果。实时荧光PCR需要有荧光曲线图与Ct值。结果记录与资料保存期限至少1年。_ _/气?/ / 兰、 / 、/ 飞/ / 一一:工;二/4 GBjT 28976-2012 附录A(资料性附录草莓潜隐环斑病毒相关资料A.1 寄主范围SLRSV寄主范围比较广。自然条件下，SLRSV可以侵染许多野生和栽培的寄主植物。在机械接种的167种双子叶植物中，受侵染的高达27科126种植物。该病毒主要为害草莓、覆盆子、欧洲甜樱桃、百合、芦笋、黑莓、黑醋栗、红醋栗、葡萄、李子、挑子、大黄和水仙等多种植物。A.2 为害症状SLRSV影响寄主植物的整个生长期，绝大多数是系

11、统性侵染但不表现症状。系统感染草莓(Fragaria spp. )、覆盆子CRubusidaeus)和欧洲卫矛CEuonymuseuro户aeus)形成不同程度的斑驳;为害欧洲甜樱桃CPrunusaviU1)、桃(Prun户ersica)、西洋接骨木CSambucusnigra)、黄瓜(Cucumissativus) 等，引起脉间褪绿和坏死等症状;为害芹菜(ApiumLinn.)形成舌形叶;为害刺槐CRobinia扣eudoacacia)造成花叶症状;还可以侵染玫瑰CRosarugosa)形成绿色环斑及矮化。A.3 分布地区欧洲z比利时、前捷克和斯洛伐克、芬兰、法国、德国、意大利、卢森堡、荷兰

12、、波兰、葡萄牙、瑞士、西班牙、英国。大洋洲:新西兰。美洲:加拿大。A.4 传播方式A. 4.1 介体传播SLRSV传播介体主要为裂尾剑线虫CXiphinemadiversicaudatum)和考克斯剑线虫CXihinemacoxi) ，并且成虫和若虫都可以传毒。A.4.2 种子及无性繁殖材料传毒病毒可通过种子及种球、块茎和苗木等元性繁殖材料远距离传播，如可以随百合和郁金香等种球的调运进行传播。该病毒为害薄荷CMenthaarvensis)、宝盖草CLamiumamplexicaule)、悬钩子CRubusLinn. )、繁缕CStellariamedia)、昆诺寨CCheno pod i um

13、 quinoa )和芹菜CAiumLinn. )等寄主植物并以种传的方式进行传播，在薄荷等寄主上的种传率超过70%。A.4.3 摩擦接种传毒SLRSV为害草本植物时，病毒的汁液易通过摩擦接种传毒。但当SLRSV为害木本植物时，其中的多酣类物质抑制了病毒的侵染性，病毒汁液应置于2%的烟碱溶液中或高pH值的缓冲液中才易接5 GB/T 28976-2012 种成功。A.5 粒体形态SLRSV颗粒大小相等，直径30nm，通常有明显的六边形轮廓。A.6 基因组SLRSV单链RNA，总长12.6kb，由两部分组成，分别长为7.8kb和4.8kb。在蛋白质组成上，SLRSV颗粒包含两种多肤分子，相对分子质量

14、分别是43kDa和27kDa，而多面体属病毒一般只有一种相对分子质量为55kDa的多肤。6 GB/T 28976-2012 B.1 10 X PBST缓冲波CpH7.4)氧化铀CNaCD磷酸二氢愣CKH2P04)磷酸氢二铀CNa2HP04)氧化饵(氯化饵)附录B(规范性附录)试剂配制80 g 2 g 11. 5 g 2 g 吐温CTween-20)5 mL 溶于900mL的蒸馆水中，用浓盐酸CHCD调节pH至7.4，并定容至1000mL。B. 2 样品抽提缓冲液CpH7.4)亚硫酸铀CNa2S03)聚乙烯基口比咯皖酣CPVP)叠氮铀CNaN3) Tween-20 1. 3g 20 g 0.2

15、g 20 mL 溶于900mL的1XPBST中，用HCl调节pH至7.4，定容至1000 mLo B.3 包被抗体缓冲液CpH9.6)碳酸铀CNa2C03)1. 59 g 碳酸氢铀CNaHC03)2.93 g 溶解于900mL蒸馆水中，用浓盐酸CHCD调节pH至9.6，并定容至1000 mL。B.4 酶标抗体缓冲液CpH7.4)1XPBST缓冲液牛血清白蛋白CBSA)PVPCMW24 00040 000) 用无菌蒸馆水定容至1000 mL。B.5 底物CpNPP)缓冲液CpH9.8)800 mL 2 g 20 g 二乙醇胶97 mL NaN3 0.2 g 溶解于600mL的无菌蒸锢水中，用浓盐

16、酸CHCl)调节pH至9.8，然后用蒸馆水定容至1000 mLo 7 GB/T 28976-2012 B.6 反应终止渣氢氧化纳(NaOH)120g溶于1000 mL的无菌蒸馆水中，浓度3mol/L. B.7 电泳缓冲液TAE(50X) 三是甲基氨基甲:皖(Tris)冰乙酸乙二股四乙酸二纳(EDTAO. 5 mol/L) 用时加蒸锚水稀释至1XTAE。B.8 滇化乙链(EB)溶渣(10g/f1L)漠化乙链灭菌去离子水8 242 g 52.1 mL 100 mL 20 mg 20 mL GB/T 28976-2012 附录C(规范性附录)双抗体酶联免疲眼附方法CDAS-ELISA)C.1 检测C

17、. 1. 1 根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上，包括2个阳性对照孔，2个阴性对照孔，2个空白P 一一平行允许率;ODj 重复样品1; ODz一一重复样品20当重复检测样品OD值平行允许率CP)小于20%时，判定检测结果有效。C. 2. 2 若满足不了C.2.1的质量要求，则不能进行结果判定。C.2.3 在满足了C.2.1的质量要求后，则按如下原则作出判定:样品OD405/阴性对照OD405值大于2，结果判定为阳性;一一样品OD405/阴性对照OD405值在阔值附近，判为可疑样品，需重做或用其他方法进行验证;一一样品OD405/阴性对照OD405值小于2，判为阴性。9 G/T 28976-

18、2012 D.1 RNA提取附录D(规范性附录)RT-PCR方法D. 1. 1 取0.1g待测样品，液氮研细，加入1mL Trizol，混匀，倒入1.5 mL离心管中。D. 1.2 加人0.2mL三氯甲烧，猛烈振荡15s ,4 .C 11 000 r/min离心10min，小心吸取上层无色水相到新离心管中。D. 1. 3 加入等体积异丙醇，混匀，一20.C静置10min, 4 .C12 000 r/min离心15min，保留沉淀。D. 1.4 加入1mL75%冷乙醇，悬浮沉淀，4oC8 000 r/min离心10min，干燥沉淀。D. 1. 5 加入30LDEPC-HzO，溶解沉淀(必要时，5

19、5.C60 .C水浴10min，加速溶解)，存于一800C备用。注2或者按照商品RNA提取试剂盒进行操作。D.2 引物序到正向引物SLRSV-F : 5 -G A TGCCT A TCGGT ACTTTGG TTC-3 ; 反向引物SLRSV-R: 5 -GT AGTTGCCGGA TTCAA TCTCC-3 。扩增片断长度298bp. D.3 反转录利用提取的RNA在PCR管中进行反转录。首先加入2L模板RNA，lL下游引物(20mol/L) ，9L DEPC-HzO混合后70.C温育5min;立即置于冰上，2min后加入4LAMV缓冲液，2LdNTPOO mmol/L) ，1LAMV反转录

20、酶(5U/-l L) ，1LRNA酶抑制剂(40U/L) , 42 .C 反应1h。也可采用RT-PCR一步法试剂盒，操作步骤按使用说明进行。D.4 核酸扩增PCR反应体系见表D.1，每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。检测时以含草莓潜隐环斑病毒材料的cDNA或含有草莓潜隐环斑病毒目标片断的质粒作为阳性对照，以健康植物材料的cDNA作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。PCR反应条件:940C3 min;94 .C 30 s、54.C45 8、72.C45 8，30个循环;72.C10 min延伸。表D.1PCR反应体系名称储存液浓度终浓

21、度加样量/LPCR缓冲液10X 1X 2.5 dNTP 2.5 mmol/L 0.2 mmol/L 2 MgC12 25 mmol/L 2.0 mmol/L 2 10 GB/T 28976-2012 名称上游引物下游引物Taq DNA聚合酶cDNA 补水至D.5 琼脂糖凝胶电泳检测王/D.5.1制 D.5.2 力日/ / 储存液浓度20 limol/L 20 limol/L 5 U/IiL 表D.l(续)终浓度0.16mol/L 0.16mol/L 0.06 U/L 于-, 加样量/L0.2 0.2 0.3 2.5 25 /川 飞将澳化乙链EB)加入到配制好的凝胶中.EB终浓度为o.5g/mL

22、。将凝胶制入踞胶槽中，插上样品梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加入lXTAE.缓r!液要没过凝肢表面的1Illm 0 /. / D.5.3 加样./ / 将加样结质量标准物(Matker)。D.5.4 接D.5.5 D. 6.1 通过观察，在298bp位点上，阳性对照应出现相应条带，阴性和空白对照不会出现相应条带，此时如果检测样品在上述位点上呈现出条带应被判为阳性，否则应被判为阴性。D.6.2 如果是阳性可通过测序的方式进一步确认。如果PCR产物序列与草莓潜隐环斑病毒的序列同源，则可判定样品为草莓潜隐环斑病毒阳性，若序列不同源，则可判定样品为草莓潜隐环斑病毒阴性。11 GB/T 28976

23、-2012 附录E(规范性附录)实时荧光RT-PCR方法E. 1 实验步骤E. 1. 1 引物和探针设计引物序列:SLRSV-FP:5-AGATGGCCTCAGTACCACCAGA-3SLRSV-RP: 5 -CCCCAAAGTGTTCCTTTCACA-3 探针序列:SLRSV-MGB-PROBE:FAM-5-CTCACCAGTATGCTGCTT-3人MGBE. 1. 2 RNA提取及反转录操作方法见附录DoE. 1.3 实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表E.l，每个样品设2个平行处理。并设阳性对照、阴性对照和空白对照，以含有草莓潜隐环斑病毒的cDNA为阳性对照;以健康植物材料的

24、cDNA作为阴性对照;以水代替DNA模板作为空白对照。每种对照各做2个平行管。表E.1实时荧光PCR反应体系名称贮备液浓度终浓度加样量/LPCR缓冲液10X 1X 2.5 MgCl2 25 mmol/L 3.0 mmol/L 3 dNTP 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5 正向引物20 ,_mol/L 0.24 ,_mol/L 0.3 反向引物20mol/L 0.24 ,_mol/L 0.3 Taq DNA聚合酶5 UIL 0.04 UIL 0.2 探针20mol/L 0.4mol/L 0.5 cDNA 2 补水至25 E. 1.4 实时荧光PCR反应参数反应条件:预变性94C

25、 IO min, 94 .C15 8 , 60 .C40 s , 72 .C40 s，共40个循环。本反应条件适用于ABI7500型荧光PCR仪，如使用其他荧光PCR仪，可根据仪器性能进行适当调整。操作方法按照仪器的使用说明进行，反应结束后保存各项数据和图像。12 GB/T 28976-2012 E. 2 结果判定E. 2. 1 阐值设定阔值设定根据仪器噪音情况进行调整，或以阔值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。E. 2. 2 结果判定在阳性样品和阴性样品Ct值正确的情况下，进行以下判定:一一待测样品的Ct值为40或元Ct值时，则判定结果阴性;一一一待测样品的Ct值小于

26、或等于35时，则判定结果阳性;一一待测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值为40时，则判定结果阴性。如果重新测试的Ct值小于40而大于35时，则判定结果阳性。13 NFON|hmNH阁。华人民共和国家标准草莓潜隐环斑病毒检症鉴定方法GB/T 28976-2012 国中 每中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)-网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张1.25 字数26千字2013年3月第一次印刷开本880X12301/16 2013年3月第一版 21. 00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107书号:155066. 1-46398定价GB/T 28976-2012 打印日期:2013年4月3日F002A