农业部1025号公告-3-2008 动物性食品中玉米赤霉醇残留检测. 酶联免疫吸附法和气相色谱-质谱法.pdf

1、ICS 67040X 00中华 人民共和 国国家标准农业部1025号公告一32008动物性食品中玉米赤霉醇残留检测酶联免疫吸附法和气相色谱一质谱法Determination of zeranol residues in animal derived foodELISA method for quick analysis and GCMS method for confirmation20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布前 言农业部1025号公告一32008本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出和归13。本标准起草单位：中国农业大学。本标准主要起

2、草人：沈建忠、肖希龙、丁双阳、李晓薇、史为民、江海洋、李建成。本标准系首次发布的国家标准。农业部1025号公告一32008动物性食品中玉米赤霉醇残留检测酶联免疫吸附法和气相色谱一质谱法第一法ELISA快速检测法1范围本标准规定了动物源食品中玉米赤霉醇残留量的制样和酶联免疫吸附测定快速检测方法(ELISA法)。本标准适用于牛尿和牛肌肉中玉米赤霉醇残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注El期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引

3、用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和实验方法3制样3 1样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试动物组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。取新鲜或解冻的尿液，6 000 rmin离心5 min，取清亮上清液。32样品的保存-20冰箱中贮存备用。4测定方法41方法原理或提要基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。酶标板的微孔包被有偶联抗原，加标准品或待测样品，再加玉米赤霉醇单克隆抗体和酶标记物。包被抗原与加入的标准品或待测样品竞争抗体，酶标记物与抗体结合。通过洗涤除去游离的抗原、抗体及抗原抗体复合物。加入底物液，使结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液，在45

4、0 nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中玉米赤霉醇浓度的自然对数成反比。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GBT 6682规定的二级水。4 2 1三氯甲烷42 2正己烷42 3乙腈424玉米赤霉醇检测试剂盒28保存。4 241包被有玉米赤霉醇偶联抗原的96孔板规格为12条8孔农业部1 025号公告一320084 2 4 24 24 34 2444 2 4 542464 2 4 642474 2 4 8玉米赤霉醇系列标准溶液浓度分别为0、0 05、0 1、0 2、0 4、0 8 pgL酶标记物工作液玉米赤霉醇抗体工作液底物液A液底物液B液终止液2倍浓缩缓冲液2

5、0倍浓缩洗涤液4 2 5一一葡萄糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶426缓冲液工作液用水将2倍的浓缩缓冲液按1：1体积比进行稀释(1份2倍浓缩缓冲液+1份水)用于溶解干燥的残留物，调pH至48，缓冲液工作液在4可保存1个月。4 2 7洗涤液工作液用水将20倍的浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在2。C8可保存1个月。4 3仪器和设备4 3 1酶标仪配备450 nlll滤光片4 32匀浆器4 3 3振荡器4 3 4离心机4 3 5微量移液器单道20 pL一200 ff,L、200 pL1 000 pL、多道250 BL4 36天平感置0 01 g

6、4 3 7分析天平感量0 000 01 g4 3 8氮气吹干装置4 4试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。45测定步骤45 1牛尿前处理步骤取尿液2mL于离心管中，4 000 rmin离心10mira取尿样10mL于另一离心管中，加葡萄糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶10ttL，37 6C水浴3 h，加三氯甲烷5mL，振荡10rain，室温4 000 rmin，离心10min，取下层有机相25 mL于50。C水浴下氮气吹干；用缓冲液工作液1 mL溶解残留物；取溶解后的提取液50“I。与缓

7、冲液工作液按1：4体积比进行稀释(样本提取液50止+缓冲液工作液200止充分混合)；取50“L作为试样用于分析。稀释倍数为10倍。4 5 2牛肌肉前处理步骤称取(1o01)g试样，加20mL水，加葡萄糖苷酸酶芳基硫酸酯酶8止混匀，37。C下酶解2 h；取出，加乙腈8 mL，振荡10 min，4 000 rmin离心5 rain；取上清50 mL，加入三氯甲烷2 mL，加正己烷6mL，涡动振荡10min，4 000 rmin离心5rain；去上层正己烷，取中间层吹干；加缓冲液工作液10mL涡动溶解，取200 pL，加缓冲液工作液800pL混合；取50pL分析。稀释倍数为10倍。，农业部1025号

8、公告一320084 5 3测定45 3 1使用前将试剂盒在室温(19。C25。C)下放置1 h2 h。4532按每个标准溶液和试样溶液至少做两个或两个以上平行实验，计算所需酶标板条的数量，插入板架。45 3 3加系列标准溶液或试样液50“L孔，再加入50 uLiL的玉米赤霉醇抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，37反应30 min。4 534倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体，加250 pL洗涤液工作液至每个孔中，5秒钟再倒掉孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。再加250“L洗涤液工作液，重复操作两遍以上(或用洗板机洗涤)。45 3

9、5加酶标记物工作液100“L孔，用盖板膜盖板，37反应30 rain。4 5 3 6取出酶标板，重复洗板步骤。45 3 7每孔加底物A液50止和底物B液50 pL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，37。C避光显色15min。4 5 3 8每孔加50”L终止液，轻轻振荡混匀，置酶标仪于450 nm处测量吸光度值。46结果判定与表述用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算。见式(1)：D相对吸光度值()一导lOO(1) DO式中：B为标准(试样)溶液的吸光度值；琢空白(浓度为0标准溶液)的吸光度值。将计算的相对吸光度值()对应玉米赤霉醇标准品浓度(“gL)的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对

10、应的试样浓度可从校正曲线算出。方法筛选结果为阳性的样品，需要用确证方法确证。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5 1灵敏度本方法在牛尿、牛肌肉中玉米赤霉醇的检出限为06 pgkg(L)。5 2准确度本方法在1”gkg(L)4 ugkg(L)添加浓度水平上的回收率为60120。5 3精密度本方法的批内变异系数15，批间变异系数20。第二法气相色谱-质谱确证法(C,CMS)6范围本部分规定了动物源食品中玉米赤霉醇及其相关物残留量的制样和气相色谱一质谱确证检测方法。本部分适用于牛尿、牛肌肉和牛肝脏中玉米赤霉酮、。一玉米赤霉醇、J8一玉米赤霉醇残留量的确证检测。7规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准

11、的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有3农业部1 025号公告一32008的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和实验方法8制样8 1样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎并使均匀。82样品的保存一20冰箱中贮存备用。9测定方法9 1方法原理或提要试样经甲醇提取，与ZEE,烷液液分配去脂，氨基固相萃取柱净化；尿液样品经乙腈提取，C，s固相萃取柱和中性氧化铝固相柱取柱净化。气相色谱质谱检测，色谱保留时间和质

12、谱选择离子共同定性，外标法定量。9 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682规定的二级水。921玉米赤霉酮对照品(Zearalanone)纯度99。922 a玉米赤霉醇对照品(aZeran01)纯度99。9 2 3口一玉米赤霉醇对照品(Taleran01)纯度99。9 2 4正己烷色谱纯。925乙酸乙酯色谱纯。9 2 6甲醇色谱纯。92 7无水硫酸钠9 2 8衍生化试剂N，0双三三甲基硅烷基一三氟乙酸胺+三甲基氯硅烷一99+1，即BSTFA+TMCS(99：1)。9 2 9氨基固相萃取柱500 mg6cc。9 2 10 c。固相萃取柱500 mg6cc。

13、9 2 11 中性氧化铝柱固相萃取柱500 mg6cc。9 2 12 95丙酮取95mL丙酮和5mL水，混匀。9 2 13玉米赤霉醇、口一玉米赤霉醇、卢一玉米赤霉醇标准贮备液(100 pgmL)称取玉米赤霉酮、n一玉米赤霉醇、卢一玉米赤霉醇对照品各001 g于100mL容量瓶，用甲醇溶解稀释定容。一200c保存，有效期6个月。9214玉米赤霉醇、口一玉米赤霉醇、卢一玉米赤霉醇标准贮备液(1鹏,mL)取100“gmL玉米赤霉醇、a一玉米赤霉醇、卢一玉米赤霉醇标准储备液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，4保存，有效期1个月。9 2 15标准工作液取适量1gmL混合标准储备液，用甲醇稀

14、释成50、100、200、500、1 000和2 000 ngmL的标准溶液。9 3仪器和设备4农业部1025号公告一32Q089 3 1气相色谱一质谱联用仪配电子轰击离子源(ED。9 3 2组织匀浆机9 3 3天平感量001 g。9 3 4分析天平感量0000 01 g。935离心机9 3 6涡旋混合器937旋转蒸发仪9 3 8固相萃取装置9 3 9恒温箱9 4试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。9 5测定步骤9 51提取和净化9 5 1 1牛组织95111提取称取(5o05

15、)g试样于50mL离心管中，加20mL甲醇，涡动1mJn，3 900 rrain离心10mln。取上层有机相于离心管中，重复提取一次，合并提取液。加20mL正己烷，手摇20次，3 500 rmin离心5min，弃上层正己烷。加15mL正己烷重复脱脂一次，下层转至100mL鸡心瓶中，50。C水浴下旋蒸至近干。加5 mL乙酸乙脂，涡动1 mln，静置10 s，转至50 mL离心管中，鸡心瓶中再加10 mL正己烷，涡动30 s，静置10 s，转至同一离心管中，涡动30 s，静置1rain，除去正己烷层，乙酸乙酯层用10mL正己烷重复脱脂一次，为备用液。9 5 1 1 2净化取氨基固相萃取柱于固相萃取

16、装置上，加无水硫酸钠2 g，用玻璃棒敲匀，依次用乙酸乙脂5 mL，正己烷5mL预洗，将备用液通过小柱，依次用正己烷10mL和正己烷一乙酸乙脂(70+30，vv)5mL洗涤，乙酸乙脂5 mL洗脱，50C水浴下氮气吹干。9512牛尿液9 51 2 1提取取5mL尿液于离心管中，涡旋混匀30 s，静置10min，加乙腈5mL，涡旋混匀10 s，4 000 rmin离心5mJn。取上清液，加15mL水涡旋混匀30 s，为C。固相萃取柱上样液。取cls固相萃取柱，依次用甲醇4mL和水5mL平衡，将上清液通过固相萃取柱，加水4mL洗涤，甲醇3mL洗脱，收集流出液，500c水浴下氮气浓缩至约100“L。9

17、5 1 2 2净化加水4mL，涡旋30 s，为二次上样液。取C。固相萃取柱，依次用甲醇4mL和水5mL平衡，将二次上样液通过小柱，水4mL洗涤，甲醇3mL洗脱，收集流出液，50 oc水浴下氮气浓缩至干。取95丙酮溶液300HL充分溶解残留物，涡旋混匀30 s，备用。取氧化铝固相萃取柱，用95丙酮溶液3 mE平衡，加备用液，加95丙酮溶液3 mL洗脱，收集流出液，50C水浴下氮气浓缩至干。9 5 2衍生化加50止衍生化试剂，涡动1min，封口，60。C衍生化15min，冷却至室温后GCMS测定。5农业部1 025号公告一320089 5 3测定9 5 31气相色谱条件气相色谱柱：DB一5MS柱，

18、30 mX025 minX025 um。载气：氦气。载气流速：10 mLmin。进样口温度：250。进样量：1“L，不分流。柱温程序：初始温度80，保持05 rain，15。Crain升至280，保持10 rain。9532质谱条件电子轰击离子源(EI)。电子轰击能：70 eV。离子源温度：230。四极杆温度：150。溶剂延迟：7 min。检测模式：选择离子检测。定性离子和定量离子见表1。表1定性离子和定量离子药物名称 定性离子，raz 定量离子，raz玉米赤霉酮 449，450，451，464 449。一玉米赤霉醇 335，433523，538 433口一玉米赤霉醇 335，433，538，

19、523 4339 5 4测定法9 5 4 1定性测定根据试样溶液中药物的含量，选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样。通过气相色谱保留时间与质谱选择离子共同定性。样品中待测药物与标准物质的保留时间相对偏差不大于25，而且其选择离子的相对丰度的差异不大于20。标准溶液和试样溶液总离子流子色谱图见图A1至A3。95 4 2定量测定分别取适量试样溶液和相应浓度的标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。9 6结果计算和表述试料中药物的含量x，以质量分数毫克每千克(“

20、gkg)或毫克每升(sgL)表示，按式(1)计算：XCXV(1) m式中：C试样液中对应的玉米赤霉醇药物的浓度，单位为微克每毫升(“gmL)；y试样液总体积，单位为毫升(mL)；m试样质量，单位为克(g)。测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。10检测方法灵敏度、准确度、精密度10 1灵敏度6农业部1 025号公告一32008本方法在牛肌肉、牛肝脏中玉米赤霉酮、a玉米赤霉醇、卢玉米赤霉醇的检测限均为1 pgkg，定量限均为2“gkg；牛尿液中玉米赤霉酮、n玉米赤霉醇、p玉米赤霉醇的检测限均为05 pgL，定量限均为1“gkg。10 2准确度本方法在1 Mgkg(L)10 pgk

21、g(L)添加浓度水平上的回收率为60120。10 3精密度本方法的批内变异系数15，批间变异系数20。农业部1025号公告一32008附录A(资料性附录)标准溶液总离子流色谱图(ZEN：玉米赤霉酮ZER：a一玉米赤霉醇；TAL：口一玉米赤霉醇)图A 1 2 0 l,gmL玉米赤霉醇及其相关物标准溶液选择离子色谱图Abund一16 60 16 80 17 00 17 20 1740 17 60 17 80 1800 18 20 18 40(ZEN：玉米赤霉酮；ZER：a一玉米赤霉醇；TAL：口一玉米赤霉醇)图A 2空白牛肝样品选择离子色谱图i0；87；5544332iAbundance151413121110986Time农业部1025号公告一3200816 60 16 80 17 00 17 20 17 40 17 60 17 80 18 00 18 20 1840(ZEN：玉米赤霉酮；ZER：a一玉米赤霉醇；TAL：口一玉米赤霉醇)图A 3 2 0 pgkg牛肝添加样品选择离子色谱图