农业部1063号公告-1-2008 动物尿液中9种糖皮质激素的检测.液相色谱-串联质谱法.pdf

1、ICS 65120B 46中华人民共和国国家标准农业部1063号公告一12008动物尿液中9种糖皮质激素的检测液相色谱一串联质谱法Determination of glucocorticoids in animal urineLiquid chromatography-tandem mass spectrometry20080715发布 20080715实施中华人民共和国农业部发布刖 置农业部1063号公告一12008本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：河南省饲料产品质量监督检验站、国家饲料质量监督检验中

2、心(北京)、北京市饲料监察所。本标准主要起草人：班付国、吴宁鹏、周红霞、贾振民、宋志超、郭芙蓉、方中意、苏晓鸥、李兰、索德成、卢光菊、邓程君。1范围农业部1063号公告一12008动物尿液中9种糖皮质激素的检测液相色谱一串联质谱法本标准规定了动物尿液中泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、氢化可的松、倍氯米松、地塞米松、倍他米松、醋酸氟氢可的松和醋酸可的松的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于动物尿液中9种糖皮质激素单个或混合物的测定。本标准的最低检测限为05 MgL，最低定量限为10 ttgL。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有

3、的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中糖皮质激素类药物经酶解后，在酸性条件下经乙酸乙酯提取，固相萃取柱净化，用洗脱液洗脱，氮气浓缩吹干，溶解后，液相色谱串联质谱法测定，外标法定量。4试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水符合GBT 6682规定的一级水。4 1泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、氢化可的松、倍氯米松、地塞米松、倍他米松、醋酸氟氢可的松和醋酸可的松对照品：纯度均大于980。4 2

4、甲醇：色谱纯。4 3乙腈：色谱纯。4 4甲酸：色谱纯。4 5乙酸乙酯。4 6乙酸。4 7亲水亲酯平衡(HI，B)固相萃取柱：500mg6mL，或等效SPE柱。4 8氨基固相萃取柱：500 mg6 mL。4 9乙酸铵缓冲液(O02toolL)：称取154 g乙酸铵，溶解于l 000mL水中，用适量乙酸调pH至52。4 10洗脱液：乙酸乙酯+甲醇(40+60，V1+V2)。4 11 30乙腈溶液：乙腈+水(30+70，Vl+Vz)。4 12 20甲醇溶液：甲醇+水(20+80，V-+Vz)。4 13 8盐酸葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶：100 000 umI。4 14标准储备液(1 mgmL)：准确称

5、取适量泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、氢化可的松、倍氯米松、地塞米松、倍他米松、醋酸氟氢可的松和醋酸可的松对照品，用乙腈分别配制成1 mgmL的标准储备1农业部1063号公告一12008液。于18以下保存，有效期为6个月。415混合标准储备液(100“gmL)：分别准确吸取泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、氢化可的松、倍氯米松、地塞米松、倍他米松、醋酸氟氢可的松和醋酸可的松标准储备液(414)500 mL，置于50 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，于一18以下保存，有效期为3个月。4 16混合标准工作液：准确吸取混合标准储备液(415)100 mL，置于100 mL容量瓶中，用30乙腈溶液

6、(411)稀释至刻度，摇匀。取陔溶液分别配制成2 pgL、5 pgL、10 vgL、20 pgL、50 pgL、100“gL工作液。于2。C8保存，有效期为1周。5仪器和设备5 1 液相色谱一串联质谱仪(配电喷雾离子源)。5 2涡旋振荡器。53高速离心机。5 4电热恒温振荡器。5 5旋转蒸发仪。5 6电子天平：精度00001 g。5 7 pH计：精度01。5 8氮气吹干浓缩仪。6试样的制备供试样品置于一18以下冷冻保存，使用前放至室温，如有混浊，离心后取上清液备用。7测定步骤7 1酶解准确吸取尿液试样5omL，置于50mL离心管内，用乙酸调pH为52(士o2)，加入002molL乙酸铵缓冲液(

7、49)50mI。，再DUA口盐酸葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶(413)50止，涡旋混匀，于37(I。C)避光振荡16 h。7 2提取酶解后放置室温。加乙酸乙酯10 mL，旋涡混合1 mln，振荡提取15 rain，移取有机相。再用10 mL乙酸乙酯提取一次，合并有机相。于40。C下旋转蒸至近干。加入2 mI。甲醇溶解残渣，再加入8 mL水，混匀，备用。7 3净化取(HLB)固相萃取柱(47)依次用甲醇、水各6 mL活化，取提取液全部过柱。依次用5 mL水、5mL20I尹醇溶液(412)淋洗，抽干。将预先用6 mL洗脱液(410)活化好的氨基固相萃取柱(48)串接在HLB固相萃取柱下方。6 mL洗脱

8、液(410)洗脱，收集洗脱液，50。C下氮气吹干。残余物用30乙腈溶液(411)05mL溶解，涡旋混匀，6 000 rrain高速离心10rain，取上清液适量，过02 pm滤膜后，供液相色谱一串联质谱仪测定。7 4测定741液相色谱参考条件a)色谱柱：BEH C18(100mrnX 21ITIITI，17“m)，或相当；b)流动相：A相：乙腈；B相：01甲酸水溶液；c)流速：03 mEmin；?d)柱温：30；e)进样量：5 uL；f)梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱条件农业部1063号公告一卜一2008时间 A相 B相mln O 25 758 35 659 80 2010 25 7512

9、25 757 4 2质谱参考条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：负离子扫描；c)检测方式：多反应监测；d)源温：110；e)雾化温度：300；f)锥孔气流速：50 Lh；g)雾化气流速：650 Lh；h)碰撞室压力：3510 3mbar；i)毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等应优化至最优灵敏度j)检测离子对见表2。表2 9种糖皮质激素的参考保留时间$Mq-HCOO一离子、特征离子保留时间 -M+HC003 特征离子药物名称泼尼松龙 353 405 3 329 4a 3594泼尼松 359 4034 3273a 3572甲基泼尼松龙 529 419 4 34348 373 3氢化可的松 3

10、65 407 4 331 38 36l 3倍氯米松 637 453 4 377 48 407 3地塞米松 5 56 4374 3614a 3913倍他米松 577 4374 361 48 3913醋酸氟氧可的松 8 07 4674 4214a 3494醋酸可的松 900 4475 3292a 4011注：a定量离子。74 3液相色谱一串联质谱测定7 4 3 1定性测定每种被测组分选择EM+HCOO离子和2个以上特征离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与混合标准溶液中对应的保留时间偏差在25之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准溶液谱图中对应的定性离子的相对

11、丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物质。3农业部1063号公告一12008表3定性确证时相对离子丰度的最大允许误差相对丰度， 50 2050 1020 10允许偏差， 士20 土25 士30 土507 4 32定量测定在仪器最佳工作条件下，对混合标准溶液进样，以峰面积为纵坐标，混合标准溶液浓度为横坐标绘制工作曲线，用单点或多点对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。上述色谱和质谱条件下，标准品特征离子质量色谱图见图A1。7 4 4平行试验按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。745回收率试验阴性样品中添加标准溶液，按以上测定步骤

12、操作，测定后计算样品添加的回收率。7 46空白试验取空白试样，按上述测定步骤操作，同时完成空白试验。8结果计算和表述试样中被测组分量按式(1)计算： x一筹式中：x试样中被测组分量，单位为微克每升(“gL)；P：试样溶液峰面积值；V样品的总稀释体积，单位为毫升(mL)；Ci标准溶液浓度，单位为微克每升(pgL)；R标准溶液峰面积平均值；m试样体积，单位为毫升(mL)。平行测定结果用算术平均值表示，保留3位有效数字。9重复性在同一实验室，由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于20。附录A(资料性附录)标准物质特征离子质量色谱图农业部1063号公告一12008MRM 0f16

13、 Chmmels ES一100 810 4674421 4_喇 儿 212e43 50 4 00 4 50 5 00 5 50 6 00 6 50 7 00 7 50 800 8 50 9 00MRM ofl6 Channels ES一100 飞川453 4377 4吲 | 212e4oLr，r-rr-r-r，#二h，一 3 50 400 4 50 5 00 5 50 6 00 6 50 7 00 7 50 800 8 50 9 00MRM of 16 Channels ES一100 9 00“7 5329 2。硎 7 05e33 50 400 4 50 5 00 5 50 6 00 6 50

14、 7 00 7 50 800 8 50 9 00MRM ofl6 Ch丑Ilnels ES一。1岛 5麓l“ ”7。4们361 403 50 4 00 4 50 5 00 5 50 600 6 50 700 7 50 8 00 8 50 9 005舄3i6 觚”赫辫譬“oL叩蔓者而矿蜀_?丽下聂矿_葡_i菇而矿_蜀叩i丽下西珊ne注：1醋酸氟氢可的松特征离子质量色谱图(467 44214)；2倍氯米松特征离子质量色谱图(4534377 4)；3醋酸可的松特征离子质量色谱图(447 5329 2)；4 地塞米松、倍他米松特征离子质量色谱图(437 4361 4)；5 甲基泼尼松龙特征离子质量色谱图(419 4343 4)；6 氢化可的松特征离子质量色谱图(4074331 3)；7 泼尼松龙特征离子质量色谱图(405 33394)；8泼尼松特征离子质量色谱图(403 4327 3)。图A 1 标准物质特征离子质量色谱图5