GB T 29396-2012 水稻细菌性谷枯病菌检疫鉴定方法.pdf

1、B E臼65.020.01B 16 中华人民共和国国家标准G/T 29396-2012 水稻细菌性谷枯病菌检疫鉴定方法Det配tionand identifition of Burkholder，归glumae(Kurita&Tabei) Urakami et aI. 2013-06-01实施2012-12-31发布中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局也士中国国家标准化管理委员会乱叩中华人民共和国国家标准水稻细菌性谷枯病菌栓瘟鉴定方法GB/T 29396-2012 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010

2、)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销锋开本880X12301/16 印张1.25 字数33千字2013年4月第一版2013年4月第一次印刷* 书号:155066. 1-46463定价21.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 29396-2012 前-E 本标准按照GBjT1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SACjTC271)提出并归口。本标准起草单位z中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中国检验

3、检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人z朱金国、莫瑾、朱水芳、赵文军、李芳荣、李一农、彭梓、钟文英。I GB/T 29396-2012 水稻细菌性谷枯病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了水稻种子和其他水稻材料的水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderiaglumae)的检疫鉴定以植物的形态学特征、生理生化特性、分子生物学和酶联免疫学技术作为依据，明确了田间观察、分离鉴定、样品保存的方法。本标准适用于水稻材料和相关环境中水稻细菌性谷枯病菌的检测，2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引

4、用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 15569-1995 农业植物调运检疫规程国际种子检验规程(lSTA)3 水稻细菌性谷桔病菌基本信息中文名z水稻细菌性谷枯病菌(颖壳伯克氏菌z颖壳假单胞菌。学名:Burkholderia glumae(Kurita&. Tabei)Urakami et a1.。异名:Pseudomonasglumae Kurita&. Tabei。病害英文名:Bacterial grain rot of rice。属细菌界Bacteria、变形菌门Proteobacteria、乙型变形菌纲Betaproteobacteria、伯克氏菌目Burkhold

5、eriales、伯克氏菌科Burkhoideriaceae、伯克霍尔德氏菌属Burkholderia。种子带菌是远距离传播的主要途径。水稻细菌性谷枯病菌的其他信息参见附录A.4 方法原理根据水稻植株的形态学特征进行田间观察，并采用分离培养、分子生物学和酶联免疫学筛选、生理生化鉴定以及致病性测定对植株材料上的水稻细菌性谷枯病菌进行判定。5 设备和材料5. 1 冷冻高速离心机z转速15000 r/min. 5.2 PCR扩增仪.5.3 恒温培养箱:28 c士1C。5.4 显微镜z物镜头10X.100X。5.5 天平E精度0.001g. 5.6 高压灭菌器.1 GB/T 29396-2012 5.7

6、 冰箱:0C4 c。5.8 均质器z转速4000 r/min8 000 r/min. 5.9 可调移液器:10L100L，100Ll000L。5. 10 器具z灭菌的慑子、剪刀、称量勺。5. 11 吸管:1mL、10mL. 5. 12 灭菌平皿z直径90mm，玻璃或一次性塑料平皿。5. 13 三角瓶:100mL. 6 培养基和试剂6.1 S-PG培养基z见B.1.6.2 CCNT培养基z见B.26.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6. 10 6. 11 O-F 6. 12 葡萄6. 13 精氨6. 14 淀粉6. 15 糖利用7 田间栓验水稻细菌性谷枯病在水接对水稻受害情况

7、进行判胁族病按以下操作进行抽样及实验8抽样-二J ，通过田间观察可直验有病害发生的植株，水稻种子抽样可参照ISTA国际种子检验规程或者GB15569-1995中6.1方法进行，9 样晶处理及分离培养9. 1 水稻种子大量种子样品先用蒸锢水冲洗后，称取10g或400粒种子放人90mL O. 001%吐温-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中低温(5C15 C)浸泡4h6 h，用均质器打碎，制备样品提取液。如果是检测少量的种子样品，取20粒种子加人10mL灭菌的0.001%吐温-磷酸盐缓冲液(pH7.0)，用灭菌槌和研钵或是搅拌器将种子充分碾磨，制成提取液。GB/T 29396-2012 将样品提取液置

8、于22c -25 c环境中4h-6h后，旋涡混匀悬浮液5min，悬浮液进行十倍梯度稀释，稀释后的10X，和100X以及1000X三个稀释度的悬浮液取0.3mL，分别放人到3个S-PG和CCNT的平皿中(每个平皿加0.1mL)。用L-型玻璃棒将液体均匀涂布在琼脂的表面。9.2 植物组织材料9.2. 1 元症状组银将10g左右样品直接放人90mL 0.001%吐温磷酸盐缓冲液中，均质1min制备成样品提取液。按6.1方法进行稀释与涂布。9.2.2 未显症状的可疑组织用灭菌的剪刀剪成2mmX7 mm大小的小块，放入S-PG和CCNT平板中，滴人2-3滴(约0.2 mL)的生理盐水，放置5min-10

9、 min，让细菌从这些组织中渗出。9.2.3 有明显症状的时片从叶片损伤部位的前端切下2mmX7 mm片段。将其放人70%的乙醇中15s-30 s，消毒叶片组织，在试管中用灭菌蒸馆水清洗叶片2-3lX后放入S-PG和CCNT平板上。10 培养分离接种后的平皿28c士1C培养3d后观察生长菌落形态，细菌性谷枯病菌在S-PG上呈现两种生长形态，一种菌落为红揭色、圆形、光滑、隆起E另一种菌落为被紫色、圆形、光滑、隆起。细菌性谷枯病菌在CCNT上产生带有黄色扩散性色素的白色菌落。用接种环从平板中挑选5个以上生长典型或疑似菌落，接种到改良SPA蛋白陈培养基培养纯化，以进行进一步生化鉴定试验，也可以采用B

10、IOLOG微生物鉴定系统进行鉴定。对疑似菌落也可以采用PCR方法进行初筛，或者采用水稻细菌性谷枯病菌的ELISA试剂盒进行初步筛选(具体检测方法参照试剂盒说明手册)，阳性结果再继续通过生化鉴定做进一步证实。11 PCR筛选试验从分离培养的细菌菌株中提取DNA作为模板，进行PCR检测和电泳分析。用水稻细菌性谷枯病标准菌株基因组DNA作为阳性对照，用不含有水稻细菌性谷枯菌株的植物组织材料或其他植物病原菌基因组DNA为阴性对照，用双蒸水作空白对照，进行PCR扩增。将扩增产物进行琼脂糖电泳分析。将分离得到的可疑菌落接种SPA斜面.培养24h-48 h后用元菌水洗下斜面上生长的菌苔，制成菌悬液。使用制备

11、好的菌悬液进行分子生物学鉴定，具体操作过程见附录C.若测试菌株的PCR产物与用性对照分子量一致，继续进行生化鉴定试验。12 生理生化鉴定12. 1 初步鉴定挑取分离培养得到的符合特征的典型或可疑菌落分别进行氧化酶试验、过氧化氢酶试验、革兰民染色和鞭毛染色观察。氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，革兰民染色阴性，极生一至多条鞭毛，大小为(0.5m-0.7m) X (1. 5m-2.5m) ，符合以上试验结果的菌落需进行以下生化鉴定实验(水稻细GB/T 29396-2012 菌性谷枯病菌生化鉴定原理及相关资料参见附录A)。12.2 硝酸盐还原试验28 c士1C培养48h后的菌悬液中加入硝酸盐还原试剂，观察

12、颜色反应，细菌性谷枯病菌能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，颜色变红。12.3 明股班化挑取纯化后菌落穿剌接种琼脂培养物后，28c士1C培养48h后，观察结果，细菌性谷枯病菌能水解明肢。12.4 O-F试瞌以接种针挑取小量纯境滴加灭菌石蜡于表面，于/日管中产酸培养基变挑取菌落荧光的阴性反阻。12.6 精氨挑取菌性谷枯病菌12. 7 葡萄挑取菌落点接种于淀结果。阳性反应为琼脂培养基蓝色，菌落或培养物周围元透明环。12.9 海藻糖利用试验浸试那于培养物表面。即刻观察环，阴性反应则整个平板呈深，呈阳性反应。挑取纯培养菌落穿剌接种于海藻糖半固体培养基，置28c士1C培养1d2 d，观察培养基有元颜色变化。细菌性

13、谷枯病菌可利用海藻糖，培养基颜色由橄榄绿色变成黄色。12. 10 纤维糖利用试验实验步骤同12.9海藻糖利用试验。细菌性谷枯病菌可利用纤维糖，培养基变成黄色.13 BIOL鉴定试验实验方法参照BIOLOG微生物鉴定系统进行鉴定。4 GB/T 29396-2012 14 致病性测定如有需要，可进一步进行致病性测试。供试水稻植株采用易感品种。用灭菌棉签蘸取在SPA培养基上培养48h的菌落，转接于灭菌水中制备成101CFU/mL108 CFU/mL的菌悬液，接种0.5mL于分囊期前的禾苗，接种35株，同时接种阳性菌液和灭菌水做为阳性和阴性对照，2周后观察禾苗生长情况，典型病征为叶辅变褐色，叶片发白，

14、芽辅卷曲F或接种1.0mL于孕穗期的水稻，接种35株，同时接种阳性菌液和灭菌水做为阳性和阴性对照，34周后观察生长情况，水稻齐穗后乳熟期的绿色穗直立，染病谷粒初现苍白色似缺水状萎凋，渐变为灰白色至浅黄褐色，病粒内外颖变色，内外颖的先端或基部变成紫褐色，护颖也呈紫揭色。谷粒枯死，稻穗呈直立状而不弯曲，多为不稽，若能结实多萎缩畸形，谷粒一部分或全部变为灰白色或黄褐色至浓褐色，病部与健部界线明显。病粒多时，穗头上翘而不下垂。15 结果报告样品中未分离到典型菌落及疑似菌落，PCR结果阴性或ELISA检测阴性的，相关生化鉴定不符合水稻细菌性谷枯病菌的生理及生化特征，报告为z未检出细菌性谷枯病菌。从样品中

15、分离到典型及疑似菌落，PCR检测阳性或ELISA检测结果阳性，并通过生化鉴定符合水稻细菌性谷枯病菌生理及生化特征的，或BIOLOG实验结果为阳性的，报告为z检出水稻细菌性谷枯病菌。必要时可进行致病性测定。16 样晶及分离物的保存保存样品由鉴定人标识确认、样品管理员登记，进行防虫处理后，阴性样品于阴凉干燥、防虫防鼠处妥善保存6个月。对检出水稻细菌性谷枯病菌的样本和分离菌株应在生物安全措施下至少保存1年，有特殊需求保存期可适当延长。保存期满，经灭活后妥善处理。分离菌株接种于SPA斜面上培养，4c下可保存几周。菌株在10%20%甘泊中或冻干，在一80c条件下可长期保存。17 处理及生物安全措施对检出

16、水稻细菌性谷枯病菌的样品及其分离菌株、检测过程中的废弃物，需经有效的除害处理方式处理，以防止对环境的扩散.5 GB/T 29396-2012 附录A(资料性附录水稻细菌性谷桔病菌其他信息A.1 分布亚洲z日本、韩国、印度尼西亚、泰国、马来西亚、菲律宾、斯里兰卡、越南、中国台湾z拉丁美洲z哥伦比亚。A.2 寄主范围水稻(Oryzasativa L)、须芒草(Andropogongayanus Kunth野古草(Arundinellahirta (Thunb. )C. Tanaka)、毛颖草(Beckmanniasyzigachne var. hirsutiflora. )、慧琼(Coixlacr

17、oyma-jobi L. var. m a-yuen (Roman. )Stapf)、弯叶画眉草(Eragrostiscurvula (shrad. ) Nees)、多花黑麦草(Loliummultiflorum Lam)、洋野泰(Panicumdichotomiflorum)、大泰(Panicummaximum Jacq)、毛花雀碑(Paspalum dilatatum Poir)、狼尾草(Pennisetumalopecuroides)、梯牧草(Phleumpratense Linn. )、芦苇(Phragmitesaustralis)、狗尾草Setariaviridis (L. ) Be

18、auvJ、攘麦(A1enasativa L)和黑麦(Secalecereale L)等。A.3 症状抽穗期病穗田间呈块状分布，稻粒呈褐色，谷粒病健部有一明显的棕色界限。病种在育苗箱中培养，常成块状腐败、枯死，轻的僵苗不发.叶辅变褐色，叶片发白，芽辅卷曲，故称苗腐、苗枯。水稻齐穗后乳熟期的绿色穗直立，染病谷粒初现苍白色似缺水状萎凋，渐变为灰白色至浅黄褐色，病粒内外颖变色，内外颖的先端或基部变成紫褐色，护颖也呈紫褐色。每个受害穗染病谷粒1O20粒左右，发病重的一半以上谷粒枯死，受害严重的稻穗呈直立状而不弯曲，多为不舱，若能结实多萎缩畸形，谷粒一部分或全部变为灰白色或黄褐色至浓褐色，病部与健部界线明

19、显。病粒多时，灌浆期穗头上翘而不下垂。瘪粒增加，品质下降z重的开花后稻粒变褐、枯死，减产很多。A.4 生理生化特性水稻细菌性谷枯病菌(B.glumae)为阴性杆菌，大小(0.5m0.7m)X (1. 5m2.5m)， 17根极鞭，好气性，有英膜，不形成芽抱。在NA培养基上菌落生长慢，圆形、隆起、光滑、灰白色z在PDA培养基上菌落小，黄乳白色F在KB培养基上不产生荧光。明胶液化，吐温-80水解，牛乳凝固，石蕃还原，硝酸还原，过氧化氢酶和卵磷脂酶阳性F但不水解熊果昔和七叶昔，不产生蝴蝶及硫化氢，淀粉水解在不同菌系间有变化，氧化酶、酷氨酸酶、精氨酸双水解酶、苯丙氨酸脱氨酶都是阴性反应。从阿拉伯糖、果

20、糖、半乳糖、葡萄糖、甘油、甘露醇、甘露糖、山梨蹲和木糖产酸，利用乳糖和棉籽糖产酸的能力在不同菌系间有变化，从糊精、菊精、麦芽糖、鼠李糖、水杨营和蔚糖不产酸。4%NaCI或5m氯霉素能抑制生长，生长最适pH6. O 7. 5，最适生长温度为28C，最高生长温度在40C，最低温度为8 C12 C，致死温度50C52 Co , GB/T 29396-2012 A.5 发病条件播种带菌病谷粒，遇有适宜的发病条件，即抽穗期高温多日照，降雨量小易发病。病菌可通过气孔和伤口侵人，病菌在植株体内繁殖，在细胞间扩散，引起叶辅薄壁组织的分解。7 GB/T 29396-2012 B.1 S-PG选择性培养基B. 1

21、. 1 成分KzHP03 NazHP03 (NH.)zSO. MgSO. .7HzO NaMoO. 2Hz 0 EDTA-Fe D-山梨蹲甲基紫苯酣红琼脂蒸锢水L-胧氨酸(1mg/100 mL) 非奈西林(5g/100 mL) 氨韦青霉素。g/100mL) 氯化十六烧基三甲镀(1g/100 mL) B.1.2 配制方法附录B规范性附录培养基及试验方法1. 3g 1. 2g 5.0 g 0.25 g 24 mg 10 mg 10 g 1 mg 20 mg 1820 g 1000.0 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 将除L-胧氨酸、非奈西林、氨韦青霉素、氯化十六烧基三甲胶以外的成分充

22、分溶解，121c灭菌15 min.使用前再添加已过滤除菌的四种溶液.B.2 CCNT选择性培养基B.2.1 成分酵母浸膏2g 高聚蛋白陈1 g 肌蹲4g 氯化十六烧基二甲镀10 mg 氯霉素10 mg 新生霉素1 mg 百菌清100 mg 琼脂18 g 蒸馆水1000.0 mL 8 . GB/T 29396-2012 B.2.2 配制方法将除新生霉素以外的其余成分充分溶解，调pH值至4.8，121c灭菌15min.使用前添加已过滤除菌的新生霉素禧液。B.3 SPA培养基B. 3.1 成分蛋白陈蘸糖KzHP04 MgS04 .7HzO 琼脂蒸锢水5.0 g 17.0g 1000 mL B. 4.

23、1 7自121吨压灭菌20min.八飞叫缓冲?;/77飞J立已乙/NaCl KCl 吐温-20水pH 7.4 B.4.2 制法B.5 草兰氏染色法B.5.1 结晶紫染色渡结晶紫0.2 g 0.01 mL 1 000 mL 19 95%乙醇20 mL 1%草酸镀水禧液80 mL 将结晶紫榕解于乙醇中，然后与草酸镀榕液?昆合。B.5.2 草兰民鹉液腆1 g 9 GB/T 29396-2012 腆化饵蒸锢水2 g 300 mL 将砚与腆化饵先进行混合，加人蒸馆水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸锢水至300mL. B.5.3 沙黄复染班沙黄95%乙障蒸锢水0.25 g 10 mL 90 mL 将沙

24、黄溶解于乙醇中，然后用蒸锢水稀释。B.5.4 染色法B. 5.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。B.5.4.2 滴加革兰式染液，作用1min，7.洗。B.5.4.3 滴加95%乙醇脱色，约30S;或将乙晖滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10S. B.6 鞭毛染色法B.6.1 染色班的配制B. 6.1.1 甲液z称单宁酸5g氧化高铁(FeC13)1.5g，溶于100mL蒸馆水中，待溶解后加入1%的氢氧化铀榕液1mL和15%的甲醒溶液2mL。B.6. 1. 2 乙液z称2g硝酸银搭于100mL蒸馆水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化镀溶液，到出现沉淀后

25、，再滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止此为关键性操作，应特别小心)。滴加氢氧化镜和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液在染色当天配制。B.6.2 染色法在风干的载玻片上滴加甲液，4min6 min后，用蒸锢水轻轻冲洗。再加乙液，缓缓加热至冒汽，维持约30S(加热时注意勿使出现干燥面)。在菌体多的部位可呈深揭色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜栓，菌体及鞭毛为深褐色到黑色。B.7 营养明肢B. 7.1 成分蛋白陈牛肉膏明胶蒸铺水pH 6. 87. 0 B.7.2 制法5g 3g 120 g 1000 mL 加热搭解、校正pH7. 47. 6，分装小

26、管，121c高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.87. 0。GB/T 29396-2012 试验方法B.7.3 用琼脂培养物穿刺接种，每天取出，置冰箱内30min后再观察结果，记录液化时间。氧化酶试验B.8 试剂1%盐酸二甲基对苯二胶榕液z少量新鲜配制，于冰箱内避光保存。l%a-荼酣-乙醇溶液。B. 8.1 B. 8. 1. 1 B. 8.1.2 -导 B. 8. 2.1 取白色洁净蹲纸沽取事落二加盐酸二甲基对本二溶事r滴，深z再加-荼酣溶液但滴，周继者于30s内呈现鲜蓝色。阴性于2m1袖不B.8.2.2 以毛细脱管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上B.

27、9 B.9.1 B.9.2 八/7 叫LL J / 装斌管，每管约5mL.IZ1 c高压灭菌15min. i/E1 试验方法B.8.2 B.9.3 B.9.3.1 B.9.3.2 试验方法接种后在28c士1C培养48h.加人甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐时于立刻或数分钟内显红色。B.9.4 过氧化氢酶试验B.10 试剂B. 10. 1 3%过氧化氢溶液:1描用时配制。试验方法B.10.2 11 挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL.观察结果。GB/T 29396-2012 B.10.3 结果于30s内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。B

28、.11 O-F葡萄糖利用培养基及配制B. 11. 1 培养基蛋白陈NaCl 0.2%滇靡香酷蓝琼脂KH2P04 葡萄糖蒸馆水B. 11.2 配制2.7 g 5.0 g 0.03 g 3g 0.3 g 10.0 g 1000 mL 以上成分除糖外，榕解调pH7.2,121 c高温灭菌20min后备用。B. 11.3 结果见表B.1.表B.1 反应类型封口的培养基发障型(F)氧化型(0)产碱型(A)B.12 葡萄糖酸盐氧化试验B. 12. 1 培养基蛋白陈酵母浸膏1. 5g 1. 0g K2HP04 1. 0 g 葡萄糖酸饵40.0 g 产酸不变不变水1000mL 一开口的培养基产酸产酸不变将各成

29、分榕化于1L水中，调至pH7.0，分装小试管，每管2mL，于116C灭菌15min. B.12.2 试剂Benedict民定性试剂(1)拧穰酸铀Na2COa 12 1. 73 g 10.0 g GB/T 29396-2012 蒸馆水60.0mL (2)CUS04 5H20 1. 73 g 蒸锢水20 mL 将榕液(1)缓慢加入于溶液(2)中，随加随即时振摇，使充分混匀。最后加水补足至100mL。B.13 精氨酸双水解酶试验用培养基(AD)B. 13. 1 培养基酵母浸膏3.0 g 葡萄糖1. 0g NaCl 30.0 g 精氨酸5.0 g 澳甲酣紫0.016 g 蒸馆水1000 mL B. 1

30、3.2 配制方法除澳甲酣紫外，将各成分加人蒸馆水中，搅拌均匀，静置约10min.加热至完全榕解，调制pH 6.7士0.1。分装于10mmX100 mm试管，每管1mLo 121 oC高压灭菌10mino灭菌后应立即取出放凉，接种培养后，培养基颜色变为深紫色的为阳性反应，变为黄色的，为阴性反应。B.14 淀粉水解实验B. 14. 1 培养基蛋白陈牛肉浸膏NaCl 琼脂可溶性淀粉水B. 14.2 配制方法5.0 g 3.0 g 5.0 g 15.0 g 3.0 g 1000 mL 将前4种成分加热溶化于500mL水中，另将淀精溶于250mL水中，将两液混合、补加水至1L、调至pH7.0，于115C

31、灭菌15mino B.14.3 试剂称取腆片1.0g和腆化饵2.0g，放烧瓶中，加少量水、以玻棒研磨，使腆片完全榕解，再加水至300 mL，移装棕色试剂瓶中，保存于冰箱，避免光线照射。B.15 糖利用试验B. 15. 1 培养基牛肉浸膏3.0 g 13 GB/T 29396-2012 蛋白陈NaCl 澳百里酣蓝(0.2%)糖类琼脂水B.15.2 配制方法10.0 g 5.0 g 4.0 mL 10.0 g 4.0-6.0 g 1000 mL 加水溶解，调至pH7.0士0.2后，再加人澳百里酣蓝和糖，分装成小试管，于121c灭菌15min. 14 唱E GB/T 29396-2012 附录C规范

32、性附录)水稻细菌性谷桔病菌的PCR检测方法C.1 试剂及配方C. 1. 1 DNA抽提擅配方1 00 mmol/L Tris- HCl,pH 8.0 250 mmol/L NaCl 100 mmol/L EDTA 100g/mL蛋白酶K. C. 1.2 CTAB沉淀班配方. 1%CTAB(质量浓度)(十八烧基三乙基漠化镜)50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0 10 mmol/L EDTA,pH 8.0 C. 1.3四缓冲撞配方10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0 1 mmol/L EDTA,pH 8.0 C. 1. 4 TAE电掠缓冲液(pH8.5)配方(50X)T

33、ris NazEDTA.2HzO 242 g 37.5 g C. 1.5 10 X电泳上样缓冲液(pH8.5)配方20%(质量浓度)Ficoll400 1.9%(质量浓度)SDSC.2 细菌DNA的提取冰乙酸蒸馆水57.1 mL 1000 mL O. 1 mol/L Naz EDT A(pH 8. 0) 0.25%(质量浓度)澳酣蓝将制备好的菌悬液移至一干净灭菌的离心管中，12000r/min离心15min，弃上清液。在沉淀中加入TE缓冲液5mL，10%SDS搭液300L.20 mg/mL蛋白酶K30L，掘匀，37C水浩孵育1h。加入等体积的三氯甲烧-异戊酶(24: 1)，掘匀。10000 r

34、/min离心5min，将上清液移至一个新离心管中。加入等体积酣-三氯甲镜-异戊醇(25: 24 :口，握匀，10000 r/min离心5min，将上清液移至一新离心管。加入0.6倍体租的异丙晖，轻轻混匀，10000 r/min离心5min，弃上清液，管中加人70%乙醇洗涤沉淀，晾干，加入50LTE缓冲液禧解DNA沉淀，-20c长期保存。注z此步骤可省略.可直接用培养的菌株稀释成lOSCFU/mL的菌悬液傲模板进行定性PCR检测.C.3 定性PCR栓测C.3.1 引物信息根据水稻细菌性谷枯病菌的165-23SrDNA间隔区序列OTS)以及编码DNA促旋酶F亚基的gyrBG/T 29396-201

35、2 NFON|mmmNH阁。基因，分别设计了BGFI-R1，BGF3-R3两对引物，操作时可任选其中一对。C.3.2 PCR反应体系C. 3.2.1 检测水稻细菌性谷枯病菌采用的PCR引物序列见表C.l.表C.1检测水稻细菌性谷桔病菌的PCR引物引物名称引物序列PCR产物大小bp BGF1 正向引物:5-ACACGGAACACCTGGGT A-3 395 BGR1 反向引物:5-TCGCTCTCCCGAAGAGAT-3BGF3 正向引物:5 -GCAGCGGCAAGGAAGACG-3 317 BGR3 反肉引物:5 -GTCGTCGCCCGACGTCTC-3 4唱唱C.3.2.2 检测水稻细菌

36、性谷枯病菌采用的PCR反应体系见表C.2.表C.2栓测水稻细菌性谷枯病菌的PCR反应体系组成加样体狈L 10XPCR缓冲液(M2+ffre)2 氯化侯(25mmol/L) 1. 6 dNTP(10 mmol/L) 0.4 TaqDNA聚合酶(1U/L) 0.7 正向引物(10pmollL) 1. 5 反向引物(10pmol/L) 1. 5 模板DNA(1ng/LL-10 ng/LL) 5 双蒸水7.3 总体积20 C.3.3 PCR反应循环参数 96 c预变性5min;96 c , 305;55 c , 305;72 c ，305，进行30个循环;72 c延伸5min;4 c保存。C.3.4 PCR扩增产物的栓测用TAE电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝肢，按比例掘匀电泳上样缓冲液和PCR产物，将混有上样缓冲液的PCR扩增产物加至样品孔中，用DNAMaker做相对分子质量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像分析仪下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍摄并记录实验结果。版权专有侵钗必究 GB/T 29396-2012 一一兀一OA唾-nu-nt eo nUE Z-VE ra-号一价书一定打印日期:2013年5月7日F002A