GB T 14700-1993 饲料中维生素B1测定方法.pdf

1、GBT 1470093 1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中维生素B1的测定方法。本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料中维生素B1的测定。萃取液的浓度范围为0.020.2 gmL（在有吸附硫胺素或影响硫色素荧光干扰物质的情况下，本标准不适用）。 2 引用标准 GB 6682 实验室用水规格 3 方法原理 试样中的维生素B1（即硫胺素C12H17ON4SCl）经稀酸消化、酶分解、吸附剂的吸附分离提纯后，在碱性条件下被铁氰化钾氧化生成荧光色素硫色素，用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的荧光强度与试样中维生素B1的含量成正比，依此进行定量测定。 4 试剂和溶液 除特殊规定外，本标

2、准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。 4.1 盐酸溶液，0.1molL：将8.5mL盐酸（GB 622）用水稀释至1000mL。 4.2 硫酸溶液，0.05molL：将2.8mL浓硫酸（GB 625）加入水中，稀释至1000mL。 4.3 乙酸钠溶液2.0molL：取164g无水乙酸钠（GB 694）或272g结晶乙酸钠（CH2COONa3H2O GB 693）溶于水，稀释至1000mL。 4.4 淀粉酶悬浮液，100gL：用2.0molL乙酸钠溶液（4.3）悬浮10g淀粉酶制剂（Takadiastase，或相当活性的其他磷酸酯酶），稀释至100mL，使用当日制备。 4.5 氯化钾

3、（GB 646）溶液，250gL。 4.6 酸性氯化钾溶液：将8.5mL浓盐酸加入至氯化钾溶液（4.5）中，惭稀释至1000mL。 4.7 氢氧化钠（GB 629）溶液，150gL。 4.8 铁氰化钾（GB 644）溶液，10gL。 4.9 碱性铁氰化钾溶液：4.0mL的铁氰化钾溶液（4.8）与氢氧化钠溶液（4.7）混合使之成100mL，此液4h内使用。 4.10 冰乙酸（GB 676）溶液，30mLL。 4.11 人造沸石（QHG 1244563，6080目）使用前必需活化，方法如下： 将适量人造沸石置于大烧杯中，加入10倍容积的热乙酸溶液（4.10），用玻璃棒均匀搅页码，1/4GB/T 1

4、4700932006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB147000a.htm动10min，使沸石在乙酸溶液中悬浮，待沸石沉降后，弃去上层乙酸液。重复上述操作两次。换用5倍其容积的热氯化钾溶液（4.5）搅动清洗两次，每次15min。再用 热乙酸溶液洗10min。最后用热蒸馏水清洗沸石至无氯离子（用10gL硝酸银水溶液检验）。用布氏漏斗抽滤，100烘干，贮于磨口瓶中备用。 使用前，检查沸石对硫胺素标准溶液的回收率，如达不到92，需重新活化沸石。 4.12 硫胺素标准溶液 4.12.1 硫胺素贮备液：盐酸硫胺素纯品（中国药典参照标准），于五氧化二磷干燥器24h，称

5、取0.0500g，溶解于ph4.54.3的20（ V V）乙醇溶液中并定容至500mL，盛于棕色瓶中低温保存。 该溶液每毫升含0.1mg硫胺素。 4.12.2 硫胺素贮备液：取硫胺素贮备液（4.12.1）10mL用酸性20乙醇溶液定容至100mL，盛于棕色瓶中低温保存。 该溶液每毫升中含10 g硫胺素。 4.12.3 硫胺素标准工作液：取贮备液（4.12.2）2mL与65mL盐酸溶液（4.1）和5mL乙酸钠溶液（4.3）混合，用水定容至100mL。现用现配。 该溶液每毫升中含0.2 g硫胺素。 4.13 硫酸奎宁（QHG 2279768）溶液 4.13.1 硫酸奎宁贮备液：称取硫酸奎宁0.10

6、00g，用0.05molL硫酸（4.2）溶解并定容至1000mL，贮于棕色瓶中低温保存。若溶液混浊则需重新配制。 该溶液每毫升中含0.1mg硫酸奎宁。 4.13.2 硫酸奎宁工作液：取贮备液（4.13.1）3mL，用0.05molL硫酸定容至 1000mL，盛于棕色瓶中，低温保存。 该溶液每毫升中含0.3 g硫酸奎宁。 4.14 正丁醇（HG 31012），其荧光强度不超过硫酸奎宁工作液的4，否则需用全玻璃蒸馏器重蒸馏，取114118馏份。 4.15 无水硫酸钠（HG 3123）。 5 仪器、设备 5.1 荧光分光光度计，备1cm石英比色杯。 5.2 电热恒温水浴。 5.3 电热恒温箱。 5.

7、4 实验室用样品粉碎机。 页码，2/4GB/T 14700932006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB147000a.htm5.5 分析天平：感量0.0001g。 5.6 注射器：10mL。 5.7 吸附分离柱：全长235mm，外径长度如下： 上端贮液槽容量约为50mL，35mm70mm；中部吸附管8mm130mm；下端35mm；下端35mm拉成毛细管。 5.8 反应瓶：具塞离心管25mL。 6 试样的制备 选取有代表性的饲料样品，至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。 7 分析步骤 7.1

8、称样：称取单一饲料、配合饲料或浓缩饲料12g（约含硫胺素420 g），精确至0.001g。维生素预混料0.250.5g，精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中。 7.2 提取 7.2.1 水解：将0.1molL盐酸（4.1）65mL加入试样瓶（7.1）中，经沸水浴加热 30min，开始加热510min内不时摇动容量瓶，以防结块。或于12112315磅高压釜中加热30min。 7.2.2 酶解：冷却容量瓶至50以下，加5mL淀粉酶悬浮液（4.4），摇匀。该试液的pH约为4.04.5，将容量瓶于4550恒温箱中保温3h，取出冷却调整ph4.5，用水稀释至100mL。 7.2.3 过滤：将试液

9、通过无灰滤纸过滤弃去初滤液5mL，收集滤液于锥形瓶中。 预混料提取液需逐级稀释，使之含硫胺素约为0.2 gmL。 7.3 提纯 7.3.1 制备吸附柱：取1.5g活化人造沸石（4.11）置于50mL小烧杯中，加入3乙酸溶液（4.10）浸泡。将脱脂棉置于吸附柱底部，用玻璃棒轻压。然后将乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中（勿使吸附柱脱水），过柱流速1mLmin为宜。再用10mL近沸的洗柱一次。 7.3.2 吸25mL提取液（7.2.3），慢慢加入制备好的吸附柱中，弃去滤液，用每份5mL近沸的水洗柱三次，弃去洗液。 7.3.3 用25mL6070酸性氯化钾（4.6）分三次连续加入吸附柱，收集洗脱液于25mL

10、容量瓶中，冷却后用酸性氯化钾定容，混匀。 7.3.4 同时用25mL硫胺素标准工作液（4.12.3）。重复7.3.17.3.3操作，作为外标。 7.4 氧化与萃取（以下操作避免紫外光照射） 7.4.1 于两只反应管中各吸入5mL洗脱液（7.3.3），记作A、B。 7.4.2 向B管加3mL氢氧化钠溶液（4.7），再向A管中加3mL氧化剂碱性铁氰化钾溶液页码，3/4GB/T 14700932006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB147000a.htm（4.9），轻轻旋摇。依次立即向A管加15mL正丁醇加塞，剧烈地振摇15s，再向B管加入15mL正丁醇加塞。共

11、同振摇90s，静置分层。 7.4.3 用注射器吸去下层水相，向各反应管加入约2g无水硫酸钠（4.15），旋摇，待测。 7.4.4 同时将5mL作为外标的洗脱液（7.3.4），置入另两只反应管，相应地记作C、D，按7.4.17.4.3操作。 7.5 测定 7.5.1 用硫酸奎宁工作液（4.13.2）调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。 7.5.2 于激发波长365nm，发射波长435nm处测定各反应管中萃取液（7.4.3）和（7.4.4）的荧光强度。 8 分析结果的计算和表述 8.1 计算公式 硫胺素（维生素B1）含量以mgkg（或gkg）表示，按下式计算：8.2 平行测定结

12、果用算术平均值表示，保留有效数3位。 9 重复性 同一分析者对同一试样同时或快速连续进行两次测定，所得结果之间的差值； 在硫胺素含量小于或等于5.0mgkg时，不得超过平均值的15。 在硫胺素含量大于5.0mgkg时，不得超过平均值的10。 在硫胺素含量大于50mgkg时不得超过平均值的5。 硫胺素（ VB1mgkg）（ T T0）（ S S0） C（ V2 V1）（ V0 m） 式中： T A管试液的荧光强度；T0B管试液空白的荧光强度；S C管标准溶液的荧光强度；S0D管标准溶液空白的荧光强度；C 硫胺素标准工作液浓度， gmL；0提取液总体积，mL；V1分取提取液过柱的体积，mL；V2酸性氯化钾洗脱液体积，mL；m 试样质量，g。页码，4/4GB/T 14700932006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB147000a.htm